- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Форма випуску та пакування.
Компоненти набору, кількість пробірок, їх вміст і маркерування наведені в табл.4.2.
Таблиця 4.2 - Комплектність набору для виділення ДНК із клінічного матеріалу
№№ |
Найменування компонентів в упаковці (напис на етикетці) |
Номінальний об’єм (см3) |
Вид пакування |
К-сть штук |
1 |
Буфер ЛБ |
30 |
Пластикова пробірка ємністю 50 см3 |
1 |
2 |
Буфер ПБ 1 |
30 |
Пластикова пробірка ємністю 50 см3 |
1 |
3 |
Буфер ПБ 2 |
50 |
Пластикова пробірка ємністю 50 см3 |
2 |
4 |
Буфер ТЕ |
2 |
Пластикова пробірка ємністю 2 см3 |
1 |
5 |
Сорбент |
1,1 |
Пластикова пробірка ємністю 2 см3 |
1 |
2 этап – власне полімеразна ланцюгова реакція. Здійснюється за допомогою комплекту № 2, який використовується для ампліфікації ДНК M.tuberculosis, M.bovis у пробах, що аналізуються, і отримані після виділення ДНК
Порядок проведення робіт.
1. Підпишіть і розставте в штатив необхідну кількість (що відповідає числу проб, котрі аналізуються) пробірок Майстер-МІКС і пробірок позитивного (К+) та негативного (К–) контролів.
2. Додайте в кожну пробірку по 20,0 мкл ПЛР – буфера. Закрийте пробірки та залишіть їх у штативі при кімнатній температурі на 10 – 15 хвилин.
3. Струсіть кожну пробірку на вортексі або центрифузі-вортексі протягом 10 – 20 секунд до повного розчинення кольорового осаду .
4. Внесіть у пробірки для проб по 5,0 мкл відповідного матеріалу, що аналізується. В контролі (пробірки К+ і К–) додайте по 5,0 мкл дейонізованої води.
5. Закрийте пробірки та перемішайте їх вміст на вортексі або центрифузі-вортексі протягом 5 сек.
Примітка. При наявності крапель рідини на стінках пробірки, помістіть пробірки в центрифугу-вортекс і центрифугуйте їх при 1500 – 2000 об/хв. протягом 5 хвилин.
6. Додайте в кожну пробірку по 30,0 – 40,0 мкл мінерального масла (1 краплю).
7. Закрийте пробірки, розмістіть їх у термоциклер (ампліфікатор) і запустіть програму ампліфікації (табл.4.3).
Таблиця 4.3 - Програма ампліфікації
Етапи апмпліфікації |
Температура (0С) |
Час (хв.) |
Кількість циклів |
1 |
95 |
5 |
1 |
|
94 |
1 |
|
2 |
65 |
1 |
5 |
|
74 |
1 |
|
|
94 |
0,5 |
|
3 |
65 |
0,5 |
35 |
|
73 |
0,5 |
|
4 |
72 |
5 |
1 |
5 |
|
Зберігання |
|
Умови проведення робіт.
Роботи з набором повинні проводитись у спеціалізованій лабораторії з дотриманням загальних і спеціальних вимог роботи на обладнанні, що використовується. Не допускається повторного використання пробірок і наконечників. При проведенні робіт слід використовувати одноразові рукавички, маски й халати.
Для якісного проведення реакції ампліфікації (забезпечення необхідної чутливості, специфічності й відтворюваності) рекомендується використання ампліфікаторів (термостатів програмних) з наступними основними парметрами:
- швидкість нагрівання не менш, ніж 2,0 0С за секунду, в діапазоні 40-97 0С; - швидкість охолоджування не менш, ніж 2,0 0С за секунду, в діапазоні 50-97 0С; об’єм пробірок – 0,5 – 0,6 см3.
Таким параметрам на цей час відповідають ампліфікатори виробництва країн СНД – тільки МС-2 “Терцик” (Росія), інших країн – типу “Mastercecler 5330 plus” (Eppendorf, Німеччина), “Progen” (Techne, Великобританія) або аналог.
Форма випуску й пакування.