Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно

(модифікована методика Богена)

Принцип каталазної реакції полягає в розщепленні перекису водню ферментом каталазою на воду й атомарний кисень, що супроводжується виділенням пухирців кисню і переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази.

Реактиви.

1. 0,5 % пірогалол: 50,0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10,0 мл дистильованої води.

2. 2,0 % пергідроль. 0,2 мл пергідролю розвести в 10,0 мл дистильованої води.

Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом, змішують і наливають у пробірку так, щоб покрити культуру.

Хід дослідження. Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6,0 – 8,0 мл суміші у пробірку з культурою. В залежності від кількості культур, що перевіряють, об’єм розчинів, які готуються, відповідно збільшують.

Облік реакції активності каталази проводять через 5 хвилин по активному виділенню пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1,5-2 години по забарвленню колоній у темно-коричневий колір.

Ступінь активності каталази позначають по 3-бальній системі:

- +++ рясне виділення пухирців кисню в 1-шу хвилину;

- + + помірне виділення пухирців кисню;

- + поодинокі пухирці.

При відсутності пухирців реакція вважається негативною ( - ).

Активність пероксидази оцінюється також по 3-бальній системі:

- + + + темно-коричневе забарвлення колоній;

- + + коричневе забарвлення колоній;

- + блідо-коричневе забарвлення колоній.

При негативній реакції колір колоній не змінюється.

Цінною реакцією для відрізнення M.tuberculosis від атипових мiкобактерiй є проба на термостабiльнiсть каталази.

Термостабiльнiсть каталази

Каталаза у кислотостійких мiкобактерiй різна. У вірулентних мiкобактерiй вона швидко і легко руйнується при нагріванні до 65 – 68 ⁰С. У атипових мiкобактерiй і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна.

Визначення активності термостабільної каталази

Готують 3,0 мл густої зависі мiкобактерiй. 1,5 мл зависі переносять у центрифужну пробірку, яку нагрівають на водяній бані при 68 ⁰С протягом 10 хвилин. Потім пробірку охолоджують і на предметне скло наносять по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту (служить контролем), на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту, відсутність - про пригнічення. На підставі цієї реакції легко відрізнити M.tuberculosis, у яких каталаза завжди термолабільна, від більшості атипових і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою.

Термостабiльнiсть каталази, так само як і її активність, враховується по 3-бальній системі.

Співвідношення окисно-відновних ферментів у різних видів мiкобактерiй показане в табл.3.3.

Таблиця 3.3 - Ідентифікація мікобактерій по окисно-відновним ферментам і ніациновій пробі

Мiкобактерii	Каталаза	Пероксидаза	Термостабiльнiсть каталази	Нiацинова проба
Атиповi	+ + +	-	+	-
M.tuberculosis, чутливі до ізоніазиду	+ +	+ +	-	+
M.tuberculosis, стійкі до ізоніазиду	+, 	-	-	+
M.bovis	+ +	+ +	-	-