4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)

В останні роки у зв’язку з широким використанням антимікобактеріальних препаратів у 19,0 – 20,0 % випадків спостерігається диспропорція між виявленням мікобактерій при бактеріоскопічному дослідженні та їх ростом при посіві патологічного матеріалу на живильні середовища. Це явище зустрічається тому, що МБТ, які спостерігаються під мікроскопом, не ростуть на загальноприйнятих живильних середовищах. Така дисоціація зумовлена впливом на МБТ антимікобактеріальних препаратів.

Для отримання більш достовірних результатів можливо використання живильного середовища ВКГ з паралельним використанням традиційних класичних середовищ (Льовенштайна-Єнсена та ін.). Ріст перших колоній на середовищі ВКГ через 2-3 доби. М.tuberculosis олігобацилярних форм та клітин зі зниженою життєздатністю і ферментативною активністю також проявляють ріст на вищезгаданому живильному середовищі через 2 – 3 доби.

Обов’язковим є постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ перед початком використання нової серії живильного середовища.

4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг

Тритижневі культури M.tuberculosis Н₃₇Rv, вирощені на середовищі Льовенштайна-Єнсена, знімають бактеріологічною лопаткою і змішують зі стимулятором росту з розрахунку 1-2 млн. мікробних тіл в 1,0 мл суспензії. Суспензію витримують у термостаті при 37 ⁰С 48 годин, після чого пересівають на чашки Петрі зі свіжоприготованим живильним середовищем ВКГ. У чашку Петрі вносять 1,5 мл суспензії і рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища, чашки Петрі не перевертають і герметично закривають клейкою стрічкою (скотчем). Посіви переглядають щодня і інкубують до 10 діб. З появою росту культури, відзначають початок росту, готують мазок, який фарбують водно-спиртовим розчином метиленового синього.

З кожної серії живильного середовища і стимулятора відбирають по 3 пробірки зі стимулятором і по 3 чашки з живильним середовищем для контролю стерильності.

На живильному середовищі після добової експозиції в стимуляторі росту штам M.tuberculosis Н₃₇Rv дає візуальний ріст, починаючи з 3 доби, рясний газонний ріст культури фіксується на 4-5 добу.

При збільшенні експозиції в стимуляторі на 1 добу підсилюється інтенсивність росту штаму M.tuberculosis Н₃₇Rv - незначний ріст визначається візуально починаючи з 2 -ої доби інкубації, газонний ріст культури - на 3-ю добу спостереження.

Штам M.tuberculosis Н₃₇Rv на щільному живильному середовищі ВКГ має характерні культуральні властивості: колонії соковиті, трохи матові з жовтуватим відтінком, по консистенції вісково-маслянисті, легко відокремлюються від агару.

При мікроскопії в першу добу МБТ проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми. На 5-у добу виявляється велика кількість паличкоподібних форм, що поступово переходять в колбоподібні клітини.

За Цілем-Нільсеном мікробні клітини не забарвлюються. Однак, добре забарвлюються простими методами - розведеним фуксином і водно-спиртовим розчином метиленового синього.

Живильне середовище ВКГ зареєстровано в Україні за № 221/00–300200 000.

Перед тим, як направляти діагностичний матеріал на посів, хворому потрібно не менше, ніж на 1 добу відмінити антимікобактеріальні препарати.

Передпосівну обробку патологічного матеріалу з метою деконтамінації і покращення гомогенізації проводять згідно загальноприйнятих методик.

Після підготовки діагностичного матеріалу його центрифугують, отриманий осад для посіву на середовище ВКГ обробляють стимулятором росту, який входить до комплексу ВКГ (окремий 10,0 мл флакончик з рідиною) в співвідношенні 1:1, а взяту в асептичних умовах кров розводять стимулятором росту порівну. Отриману суспензію (дослідний матеріал + стимулятор росту) інкубують при температурі (37,0 ± 1,0) ⁰С протягом 24 - 48 годин. Живильне середовище ВКГ готується безпосередньо перед застосуванням. Для цього беруть 9,0 г сухого середовища ВКГ, розмішують його в 100,0 мл дистильованої води, кип’ятять 2 - 3 хвилини до повного розплавлення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, стерилізують (121,0 ± 1,0) ⁰С протягом 15 хвилин у автоклаві. Після стерилізації розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6,0 –8,0 мм. Готове живильне середовище жовтого кольору і повинно відповідати рН 7,2 ± 0,2. Для цього дистильовану воду для його приготування треба брати з рН 7,2 ± 0,2. Після застигання середовища негайно проводять посів у дозі 1,5 мл за допомогою шприца одноразового використання на чашку Петрі. Засіяний матеріал, не перевертаючи чашки, поміщають у термостат при температурі (37,0 ± 1,0) ⁰С для виявлення росту.

Для підвищення ефективності культуральної діагностики та доцільності контролю контамінації патологічного матеріалу, який підготовлений з стимулятором росту, посів проводять за загальноприйнятою методикою на додаткові живильні середовища – 5,0 % кров’яний агар, жовточно-сольовий агар.

Оцінка результатів. Проводиться візуально щодня протягом 10 діб. Ріст колоній на середовищі ВКГ проявляється у вигляді злегка жовтуватих непрозорих колоній або газонного росту, як правило, на другу-третю, а інколи на четверту добу. Наявність росту колоній на інших живильних середовищах вказує на недостатню обробку патологічного матеріалу для бактеріологічного посіву.

Отримані культури на живильному середовищі ВКГ використовуються для приготування мазків за загальноприйнятою методикою та фарбування простими методами. У першу добу мікобактерії проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми, які поступово переходять у колбоподібні клітини.

Для верифікації олігобацилярної культури мікобактерій необхідно зробити її змив. На живильне середовище наносять 2,0 – 3,0 мл стерильної дистильованої води (не фізіологічного розчину !) та за допомогою пастерівської піпетки відсмоктують отриману суспензію, переносять у стерильну центрифужну пробірку, додають 12 - 15 крапель 10,0 % розчину їдкого лугу, добре струшують до повної гомогенізації і центрифугують при 1500 обертах 10 хвилин. Отриманий осад використовують для посіву на середовища Льовенштайна-Єнсена і Фінна-2 (але без малахітового зеленого). Одержати ріст мікобактерій (бактеріальні форми) стає можливим на середовищі Фінна-2 на 10-16 добу, на середовищі Льовенштайна-Єнсена пізніше – на 18-25 добу. Приготовлені мазки культур у початковий період росту на цих живильних середовищах дозволяють знайти велику кількість дрібних і великих кулеподібних форм, іноді гіллястих. Однак, щоденна мікроскопія показує поступове збільшення паличкоподібних форм, які розташовуються зрідка паралельно, іноді під кутом чи скупченнями різної форми, але частіше зустрічаються нитковидні утворення, що складаються з паличок, вигнутих по довжині, іноді дугоподібних, потовщених на одному чи обох кінцях. Клітини в цей період не забарвлюються за Цілем-Нільсеном. У процесі подальшого росту ниткоподібні утворення деструктуризуються і розпадаються з утворенням паличкоподібних форм, характерних для мікобактерій, тонких, паличкоподібних клітин з характерною властивістю кислотостійкості.

Запропоновану методику посіву вважають дуже інформативною, а в разі необхідності проводять біологічну пробу з використанням морських свинок.

Ідентифікація M.tuberculosis. Для швидкої ідентифікації мікобактерій з олігобацилярного матеріалу можна використовувати метод мікрокультивування мікобактерій на скельцях за Прайсом та метод ПЛР.

Облік результатів. Проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 ⁰С. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують, обережно відмивають водою від крові, підсушують, фіксують над полум’ям, забарвлюють за Ціль-Нільсоном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії, що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути, так звані “коси”, які складаються з великої кількості щільно притиснутих одна до одної клітин. Корд-фактор (тригалоза–6,6–диміколат), що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних “кіс” і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити, що предметне скельце повинно бути лише новим, без подряпин, добре відмитим, обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим.

Важливим при диференціації є виявлення відсутності термостабільної каталази, що вказує на належність їх до M.tuberculosis або M.bovis.

Докладний опис мікробіологічного дослідження на туберкульоз з використанням середовища ВКГ зі стимулятором росту приведено в методичній розробці “Мікробіологічні методи обстеження хворих на туберкульоз” (Методичні рекомендації / В.В.Власенко і співавт. – 2001. – 24 с.).

4.4 Генодіагностика: визначення наявності ДНК M.tuberculosis і M.bovis

у діагностичному матеріалі від хворих на туберкульоз за допомогою

полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

B ряду сучасних генетичних технологій метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) займає особливе місце. Метод ПЛР піднімає генодіагностику на принципово інший рівень - рівень визначення ДНК чи РНК, що дозволяє провести пряме виявлення інфекційного агента, або генетичної мутації. За допомогою ПЛР одна молекула ДНК певного інфекційного агента може бути виявлена в присутності мільйонів інших молекул ДНК. Особливо ефективним виявилося застосування методу в медицині, де в останній час використовується велика кількість різних комерційних наборів для ПЛР-діагностики. Особливо наочні переваги методу для діагностики позалегеневих форм туберкульозу та визначення резистентності M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів.

Принцип. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації in vitro, за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити визначену послідовність ДНК у кількості, що перевищує вихідну в мільйони разів. ПЛР - це процес, що протікає в одній пробірці та складається з повторних циклів ампліфікації (розмноження, копіювання) специфічної послідовності молекули ДНК із метою одержання достатньо великої кількості копій, що можуть бути виявлені звичайними методами детекції.

Одним із ключових компонентів реакції є "праймери" - синтетичні олігонуклеотиди, що складаються з 15-30 основ, комплементарних "сайтам" (ділянкам) відпалення (приєднання) на матричній ДНК, що ідентифікується. Процес підбору ефективних праймерів для ПЛР включає дизайн, синтез, перевірку якості синтезованих праймерів, а також аналітичну і клінічну чутливість і специфічність ПЛР. Праймери підбираються на консервативні ділянки ДНК інфекційного агента таким чином, щоб забезпечити ампліфікацію тільки обраного специфічного фрагмента.

Кожен цикл ПЛР складається з трьох стадій, що протікають при різних температурах: денатурації, відпалення та подовження. Під час 1-ої стадії - денатурації - відбувається плавлення ДНК при температурі 95 ⁰С, при цьому нитки ДНК роз’єднуються та стають доступними для праймерів. При відпаленні ("anneling") реакційна суміш охолоджується до температури, що є оптимальною для приєднання "праймерів" до нитки ДНК. Подовження починається від праймерів і каталізується ферментом ДНК-полімеразою при оптимумі температури 72 ⁰С.

Полімеразна ланцюгова реакція протікає автоматично в програмованому термостаті- термоциклері (ампліфікаторі). Трьохступінчатий цикл, у результаті якого виходять точні копії ділянки матричної ДНК, що ідентифікується, повторюється 30-50 разів відповідно до заданої програми термоциклера. З кожним новим циклом число молекул матричної ДНК подвоюється, тобто кількість копій наростає в геометричній прогресії.

Хід дослідження. Виявлення збудників туберкульозу в клінічних ізолятах методом ПЛР може бути виконано за допомогою «Набору реактивів для виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти M.tuberculosis, М.bovis (“MYC– ТЕSТ”), що складається з трьох комплектів: № 1 - для виділення ДНК із клінічного матеріалу, № 2 - для ампліфікації ДНК M.tuberculosis, М.bovis, № 3 - для поділу ДНК методом електрофорезу в гелі агарози.

Набір MYC – ТЕSТ забезпечує ампліфікацію фрагмента інсерційного елемента IS 6110 хромосоми M.tuberculosis, М.bovis і дозволяє знайти 50 клітин мікобактерій.

Процедури підготовки проб та аналізу матеріалу прості у виконанні, не вимагають дорогого обладнання, що робить можливим застосування методу ПЛР для ідентифікації комплексу M.tuberculosis, М.bovis на базі обласних протитуберкульозних диспансерів у найближчі часи.

Використання методу підрощуваня при дослідженні харкотиння на рідкому живильному середовищі у системі MGIT з наступним добором проб і визначенням у них ДНК M.tuberculosis/bovis методом ПЛР, істотно підвищує чутливість діагностичного методу та надає йому додаткові переваги в порівнянні з традиційними культуральними методами.

Процедура аналізу клінічного матеріалу складається з 3-х етапів.