- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
Бактеріоскопічний метод дослідження залишається одним з основних. Перевага цього методу - в його швидкості. Але можливості його обмежені: при прямій бактеріоскопії мазка, забарвленого за Цілем-Нільсеном, мікобактерії туберкульозу можуть бути виявлені тільки при дуже великій їх кількості - 5 000 - 10 000 бактеріальних клітин і більше в 1,0 мл патологічного матеріалу. Хворі, особливо в процесі антибактеріальної терапії, часто виділяють мікобактерії в значно меншій кількості, тоді цей метод може виявитися недостатньо чутливим для їхнього виявлення. У таких випадках застосовують методи “збагачення” патологічного матеріалу.
Приводимо методику прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном (п.2.2.1). Метод прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном доцільно використовувати як попереднє дослідження, однак у світовій практиці і за рекомендаціями ВООЗ у даний час досліджується осад патологічного матеріалу, який отримується після попередньої гомогенізації матеріалу з наступним його центрифугуванням (метод збагачення).
2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
Принцип методу грунтується на здатності M.tuberculosis після забарвлення їх фуксином при прогріванні утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення в сірчаній кислоті або в солянокислому спирті.
Реактиви
1. 1,0 % розчин основного фуксину (1,0 г основного фуксину розтирають із 2-3 краплями гліцерину, додають по краплі 10,0 мл 96 % етилового спирту і 90,0 мл 5,0 % розчину фенолу (5,0 г кристалічного фенолу або карболової кислоти в 100,0 мл дистильованої води)). Розчин лишають на добу, потім фільтрують через паперовий фільтр. Зберігають у темному місці при кімнатній температурі в добре закритому посуді.
2. Знебарвлюючі розчини: 20,0 % сірчана кислота (20,0 мл концентрованої Н2SO4 додають до 80,0 мл стерильної дистильованої води); 3,0 % солянокислий спирт (3,0 мл концентрованої соляної кислоти додають до 97,0 мл 70 % етилового спирту).
3. Дофарбовуючий розчин: 0,25 % метиленового синього (0,25 г метиленового синього на 1,0 л дистильованої води).
4. Фільтрувальний папір.
Всі розчини маркіруються і зберігаються в посуді з темного скла при кімнатній температурі протягом 6-12 місяців.
Спеціальне обладнання
Мікроскоп з імерсійним об’єктивом
Газовий або спиртовий пальник
Предметні скельця
Дерев’яна паличка
Хід дослідження
Приготування мазка харкотиння:
Візьміть нове, чисте предметне скельце без подряпин й напишіть з одного боку шифр пацієнта.
Перенесіть необхідну кількість досліджуваного матеріалу за допомогою аплікатора або бактеріологічної петлі. Для приготування мазків використовуйте непрозорі, сіруваті або жовтуваті творожисті маси, які присутні в харкотинні.
Матеріал необхідно розподілити по предметному скельцю тонким шаром на площі приблизно 1,0 см на 2,0 см. Мазок повинен бути достатньо тонким, щоб його можна було легко мікроскопіювати. На кожному предметному скельці повинно бути не більше одного мазка.
Залишіть мазок для підсихання на 15 хв. при кімнатній температурі. Не підсушуйте мазок підігріванням.
Фіксуйте препарати, використовуючи один із наступних методів:
- Проведіть скельце (мазком догори) через полум’я 3-4 рази. Не перегрівайте мазок. Перед забарвленням мазок необхідно охолодити.
- Фіксуйте мазки не менше 2 годин на електронагрівачі для сушки предметних скелець (при температурі + (65 - 75) 0С).
Цінність мазків при дослідженні іншого біологічного матеріалу (не з легень)
Так як туберкульозні бактерії можуть вражати майже будь-які органи, лабораторія може отримувати для дослідження різноманітний матеріал, наприклад, біологічні рідини, тканини, гній та сечу. Результати бактеріоскопічного дослідження цих матеріалів мають обмежене значення, тому в таких випадках рекомендується використовувати культуральний метод дослідження.
Промивні води шлунка.Не слід використовувати проби промивних вод шлунка для приготування мазків, так як при цьому можуть бути отримані некоректні результати. Кислотостійкі сапрофітні бактерії нерідко присутні у воді та в харчових продуктах, з якими вони можуть потрапити в шлунок. При бактеріоскопічному дослідженні неможливо віддиференціювати такі мікроорганізми від туберкульозних бактерій.
Мазок з гортані.Мікроскопія мазків з гортані не представляє цінності. Негативні результати нічого не значать, тому краще зберегти такий матеріал для культурального дослідження.
Гній та густий аспірат.Мазки з такого матеріалу повинні бути дуже тонкими. Товсті мазки звичайно змиваються з предметних скелець, а якщо вони й зберігаються на склі, то все одно після забарвлення дуже важко віддиференціювати кислотостікі бактерії. Труднощі можуть виникнути й при наявності в мазку великої кількості крові, так як іноді елементи крові можуть бути причиною утворення кислотостійких артефактів.
Плевральна рідина.Матеріал з плевральної рідини повинен бути відцентрифуго-ваний, після чого для приготування тонкого мазку використовують осад.
Спиномозкова рідина.Мікроскопія мазків із спиномозкової рідини рідко дає позитивні результати, а осад концентрованої рідини краще використовувати для посіву.
Сеча.Мікроскопія мазків із осаду відцентрифугованої сечі не дозволяє отримати достовірні результати, тому бактеріоскопічне дослідження сечі проводити недоцільно.
Фарбування мазків.
Помістіть маркіровані предметні скельця на підставку (“санчата”) групами (максимально по 12 штук) так, щоб вони не торкалися один одного.
Налийте на кожне скло достатню кількість розчину Ціля-Нільсена (карбол-фуксину), який був профільтрований перед використанням, або накрийте кожний препарат стрічкою фільтрувального папірця, якщо розчин перед використанням не фільтрувався.
Обережно підігрівайте препарат до появи парів. Не доводити до кипіння. Ні в якому разі не доводьте до повного випарювання рідини.
Якщо були використані стрічки фільтрувального папірця, необхідно видалити їх пінцетом. Обережно промийте скельце під струменем води до повного видалення барвника.
Нанесіть знебарвлюючий розчин (максимум на 3 хв.).
Ретельно промийте скельце водою. Видаліть залишки води.
Нанесіть на предметне скельце дофарбовуючий розчин (на 30-60 сек.).
Ретельно промийте скло водою. Видаліть залишки вологи. Залишіть мазок сохнути на повітрі. Не промокайте препарат.
Примітка: Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів бактеріоскопії рекомендується знебарвлюючі та дофарбовуючи розчини наносити безпосередньо на мазок. Слід відмовитися від занурення скелець з мазками в посуд із знебарвлюючими та дофарбовуючими розчинами.
Оцінка результатів. Препарат мікроскопують під імерсією. На перегляд препарату звичайно потрібно біля 15 хвилин. Цього часу достатньо, щоб виявити поодинокі мікобактерії в препараті. В цьому випадку необхідно переглянути не менш 300 полів зору.
В останній час при мікроскопії можна спостерігати морфологічні і тінкторіальні зміни M.tuberculosis під впливом антимікобактеріальних препаратів, що приводить до утруднення диференціації їх від атипових і сапрофітних мікобактерій. Відомо, що М.tuberculosis можуть частково змінювати кислотостійкість, набувати кокоподібної, сегментоподібної форми, а також подвійних коків, розташованих бобоподібно, як всередині лейкоцитів, так і самостійно. Це ускладнює їх диференціацію.
Кількість мікобактерій в мазку (або колоній в пробірці при культуральному методі дослідження) в процесі антимікобактеріальної терапії є орієнтовним показником її ефективності або непрямим свідченням розвитку стійкості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів. Якщо в процесі лікування кількість мікобактерій у препараті не зменшується в порівнянні з початковим - терапію хворого варто змінити.
Дуже важливо визначити живі чи неживі мікобактерії, оскільки вирішити це питання неможливо шляхом фарбування мазка за Цілем-Нільсеном. З цією метою приготований мазок фіксують над полум’ям, фарбують 1,0 % розчином малахітового зеленого протягом 5 - 10 хвилин, підігріваючи мазок до появи парів. Після цього фарбу зливають, мазок промивають водою і забарвлюють карболовим фуксином (в розведенні 1:5) протягом 5 хвилин. При цьому живі мікобактерії фарбуються в зелений колір, а нежиттєздатні - в червоний. Цитохімічний метод визначення життєздатності мікобактерій застосовують для проб з великою кількістю мікобактерій.
Предметні скельця використовуються лише нові. Мазки з позитивними результатами знищують в установленому порядку, так як на скельцях можуть зберігатися мікобактерії попередніх аналізів.