Метод Таке

Іншим способом визначення амiдазної активності є бактеріологічний якісний тест Таке.

Принцип методу полягає в появі специфічного іржавого забарвлення при додаванні реактиву Несслера до зрілих культур МБТ, які виросли на агаровому середовищі, яке містить аміди, що і є свідченням про достатнє утворення ацетиламідази мікобактеріями в процесі їх росту.

Реактиви.

1. Нiкотинамiд.

2. Пiразинамiд.

3. Сечовина.

4. Реактив Несслера.

5. Агарове середовище: пептон, натрій хлористий, глюкоза, калій фосфорнокислий однозамiщений (КН₂Р0₄), гліцерин.

Хід дослідження. Приготування агарового середовища: 1,0 г пептону, 20,0 г агар-агару або агару Діфко, 5,0 г NaCl, 0,1 г глюкози, 2,0 г КН₂Р0₄, 10,0 мл гліцерину розчиняють у дистильованій воді при нагріванні, доводячи кінцевий об’єм до 1,0 літра, рН - 6,9. Гаряче середовище розливають по пробірках і автоклавують при 120 ⁰С 30 хвилин. Після стерилізації агар у пробірках скошують. Готують розчини амiдiв у дистильованій воді: сечовина – 40,0 мг/мл, нiкотинамiд – 30,0 мг/мл, пiразинамiд – 20,0 мг/мл.

Розчини нiкотинамiду і пiразинамiду стерилізують у водяній бані при 100 ⁰С протягом 30 хвилин. Розчин сечовини фільтрують через бактеріальний фільтр (Зейця). Стерильний розчин амiдiв вносять пo 0,25 мл у пробірки з живильним середовищем і лишають останні в горизонтальному становищі 2-3 доби, так, щоб розчин всмоктався в поверхню живильного середовища. (За підрахунками, кількість сечовини, нiкотинамiду і пiразинамiду на 1,0 см² поверхні середовища складає відповідно - 1000, 750 і 500 мкг/см²).

У пробірки з амідами засівають 0,2 мл густої зависі культури випробовуваних мiкобактерiй (1,0 мг/мл). Посіви iнкубують при 37 ⁰С. Як тільки з’явиться ріст (через 2-3 тижні) додають 0,5 мл реактиву Несслера. Поява іржавого забарвлення свідчить про позитивну реакцію ( про наявність у бактерій відповідної амідази). Контролем є посіви в пробірках без амiдiв.

Різні види мiкобактерiй відрізняються по ферментативній активності стосовно різних амідів. Ці розходження подані в табл. 3.2.

Таблиця 3.2 - Амідазна активність окремих видів мікобактерій

Група	Види	А М І Д И
за Раньоном	мікобактерій	сечовина	нікотинамід	піразинамід
	М. tuberculosis	+	+	+
	M. bovis	+	-	-
I	M. kansasii	+	+	-
II	M. gordonae (M. aquae)	-/+	-	-
II	M. scrofulaceum	+	+	+
III	M. avium	-	+	+
III	M. xenopi	-	+	+
III	M. intracellulare	-	+	+
III	M. terrae	-	+	+
IV	M. fortuitum	+	+/-	+/-
IV	M. smegmatis	+	+	+
IV	M. phlei	+	+	+

Позначення: + реакція позитивна, - реакція негативна, +/- реакція може бути

позитивною або негативною