- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
Принцип. Метод грунтується на здатності атипових мікобактерій ІУ групи рости на середовищі з 5 % NаСl. Крім цієї групи, на даному середовищі ростуть тільки M.terrae complex (включає M.triviale, M.terrae, M.nonchromogenicum (ІІІ група)) і M.flavescens (ІІ група), а також деякі мікобактерії I групи (M.marinum). Всі інші мікобактерії, у тому числі M.tuberculosis і M.bovis, на цьому середовищі не ростуть.
Інгредієнти.
1. Натрій хлористий (хімічно чистий).
2. Сольова основа середовища Льовенштайна-Єнсена.
3. Яєчна суміш середовища Льовенштайна-Єнсена.
До сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена додають хлористий натрій із розрахунку 5,0 г на 100,0 мл сольової основи (5,0 %). Отриманий розчин стерилізують при 121 0С 20 хвилин. Далі готують середовище, як указано в рецепті приготування середовища Льовенштайна-Єнсена.
На всі вказані вище середовища засівають по 0,2 мл зависі досліджуваної культури.
3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
Крім росту на цих середовищах, використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. Атиповi мікобактерій ростуть дифузно у вигляді кучок, на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій, що ростуть плівкою, або придонно, мають корд-фактор і ростуть у вигляді “кіс”, “джгутів”, “вусів” – у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може служити диференціальною ознакою. Проте, стійкі до препаратів групи ГІНК мікобактерії туберкульозу цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від атипових визначення корд-фактору треба використовувати в комплексі з іншими тестами. Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій (М.bovis і атипових мікобактерій) використовують різноманітні біохімічні методи, що у комплексі з біологічним методом дозволяють ідентифікувати культури.
3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
Для відрізнення M.tuberculosis від інших мiкобактерiй, а також для розрізнення М.tuberculosis від М.bovis проводять наступні визначення: 1) вміст ніацину, 2) нікотинамі-дазної активності, 3) нітратредуктазної активності, 4) каталазної і пероксидазної активності.
3.2.2.1 Ніациновий тест
Є одним з основних. Він дає можливість відрізнити M.tuberculosis від інших мiкобактерiй.
Принцип. Відомо, що M.tuberculosis синтезують нікотинову кислоту (ніацин) у 10 разів більше, ніж M.bovis або атиповi. На цій підставі були запропоновані хімічні методи визначення нікотинової кислоти за допомогою ціанистих сполук, з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового.
Порівняльне вивчення різноманітних методів визначення нiацину показало, що найбільш результативним із них є модифікований метод Беніні і Лиюбоа, дещо модифікований і описаний Є. И. Тюрі і М. Є. Тюрі (Лабораторное дело. - 1964. - № 7).
Вказаний метод визначення нiацину вимагає для роботи застосування ціанистого калію, робота з яким повинна проводитися під витяжною шафою і вимагає певних умов, що обмежує широке застосування цього тесту. У зв'язку з цим, особливої уваги заслуговує метод визначення нiацину паперовими смужками, запропонований Кубика і Кильбурн, у модифікації Бараускене (Проблемы туберкулеза. – 1973).
Визначення нiацину паперовими смужками.
Перевага цього методу - у використанні замість ціанистого калію роданистого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій, а також у швидкості реакції, що дозволяє через 3-4 години дати відповідь про належність культури, що виросла на щільному середовищі, до M.tuberculosis або до інших мікобактерій.
Принцип методу полягає в екстракції нiацину з мiкобактерiй дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок, просочених реактивами.
Приготування реактивів.
1. 20,0 % розчин ПАСК. У пробірку наливають 1,75 мл 95% спирту, 0,25 мл диметилсульфоксиду (димексиду) і додають 400,0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані при 56 0С протягом 5-10 хвилин при періодичному струшуванні до повного розчинення ПАСК.
2. 60,0 % розчин роданистого калію. Наважку 1,5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2,5 мл 8,0 % розчину лимонної кислоти (200,0 мг лимонної кислоти і 2,5 мл дистильовані води).
3. 50,0 % розчин хлораміну «Б». 3,125 г хлораміну «Б» розчиняють у 6,25 мл дистильованої води на водяній бані при температурі 56 - 60 0С при струшуванні. Гарячий розчин капають на смужки.
4. Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки, розміром 60 x 8 мм, відзначають простим олівцем. Відтягнутими пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у наступному порядку: 20,0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець, 60,0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50,0 % розчин хлораміну “Б”- на інший кінець. Між краплями повинні залишатися сухі проміжки. Папірці висушують при кімнатній температурі в темряві протягом 24 годин, після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках, закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом 3-х місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендується наносити повторно 1 краплю хлораміну «Б» на вже висохлу краплю.
Хід дослідження. Водяний екстракт мiкобактерiй одержують шляхом додавання в пробірку з культурою 1-1,5 мл дистильованої води і витримування пробірок у горизонтальному положенні, щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 2-3 годин у термостаті. Потім 0,6 мл екстракту мiкобактерiй відсмоктують мірною піпеткою в пробірку.
Індикаторну смужку поміщають кінцем, поміченим олівцем, у пробірку з 0,6 мл досліджуваного екстракту мiкобактерiй. Пробірку закривають гумовою коркою і погойдують, поки уся смужка не просочиться екстрактом. При позитивному нiациновому тесті через 16-30 хвилин рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10,0 % розчину нашатирного спирту.
Використання паперових смужок для визначення нiацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях.
В даний час існують комерційні набори готових папірцевих смужок для проведення ніацинового тесту, що значно його спрощує і стандартизує.