- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
Важливою реакцією для ідентифікації мiкобактерiй всередині ІІ і ІІІ груп (за Раньоном), є реакція гiдролiзу твiну-80. Твiн-80 зв’язує нейтральний червоний, і суміш до реакції має солом'яно-жовтий колір. Принцип реакції - у ензимному гiдролiзі твiну-80. При цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного. Позитивна реакція відзначається у M.aquae (на відміну від M.scrofulaceum, у яких реакція негативна), а з ІІІ-ї групи вона позитивна тільки у M.terrae.
Реактиви.
1. 1/15 М фосфатний буфер (рН – 7) - 100,0 мл.
2. Твiн - 80 - 0,5 мл.
3. Основний нейтральний червоний, 0,1 % - 2,0 мл. Краще розчинити 0,1 г нейтраль-рот не в 100,0, а в 85,0 мл дистильованої води.
Змішати усі три реагенти. Розлити по 4,0 мл у пробірки й автоклавувати при 120 0С 15 хвилин. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше 2-х тижнів.
Хід дослідження. Емульгують 3 бактеріологічні лопатки культури в пробірках із приготованим субстратом ( твiн-80 із нейтральним червоним). Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 години, на 5-у і 10-у добу. Тест вважається позитивним, якщо рожево-червоне забарвлення з’явилося до 10-ої доби, негативним, якщо забарвлення не з’явилося (модифікована методика Вайна). Контролем є пробірка з середовищем без реактивів.
3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
При описанні біохімічних тестів ми зупинилися на найбільш простих пробах, що дають можливість відрізнити M.tuberculosis від атипових і розрізняти деякі види атипових мікобактерій всередині груп Раньона. При диференціації мікобактерій варто пам’ятати, що, крім використання комплексу тестів, застосованих при вивченні атипових культур, необхідно користуватися обов’язковими для кожного виду тестами (так звані ключові тести), проведення яких полегшує ідентифікацію культур. Наводимо ключові тести для окремих видів мікобактерій (табл.3.4).
Крім перерахованих тестів, для всіх безпігментних культур необхідно визначати нiацинову пробу, і якщо вона негативна, перевіряти амідазну активність. Використання описаних тестів дає можливість розділити атиповi культури на патогенні для людини і випадкові супутні сапрофіти, які не впливають на захворювання.
Для клініки особливе значення мають наступні види атипових мiкобактерiй:
M.kansasii, M.marinum, M.scrofulaceum , M.xenopi,
M.avium, M.intracellularae, M.fortuitum
Для атипових мiкобактерiй, крім вказаних нами особливостей (швидкості росту, пігментоутворення, морфології колоній і паличок, температурного оптимуму) характерними являються: негативна нiацинова проба, відсутність пероксидазної активності при високій активності каталази, виражена термостабiльнiсть каталази у більшості мiкобактерiй, ріст на живильних середовищах із паранітробензойною кислотою і саліциловокислим натрієм, відсутність в більшості випадків корд-фактору. Характерним також для атипових мiкобактерiй є первинна стійкість до більшості антимікобактеріальних препаратів.
Для відрізнення М.tuberculosis і М.bovis від нетуберкульозних мiкобактерiй, відмінності їх один від одного, а також для розрізнення атипових мiкобактерiй всередині груп зручно користуватися розміщеними нижче схемами.
Таблиця 3.4 – Ключові тести для окремих видів мікобактерій
Види мiкобактерiй |
Тести |
Результати тесту, властиві для даного виду мiкобактерiй |
M.tuberculosis |
Швидкість росту Нiацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 0С Утворення пігменту в темряві Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл ПНБ |
Повільний + + - - - |
M.bovis |
Швидкість росту Нiацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 0С Утворення пігменту в темряві Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл ПНБ |
Повільний - - - - - |
M.kansasii |
Швидкість росту Відновлення нітратів Каталаза при 68 0С Утворення пігменту після освітлення Гiдролiз твiну-80 |
Повільний + + + + |
M.scrofulaceum |
Швидкість росту Каталаза при 68 0С Утворення пігменту в темряві Гiдролiз твiну-80 |
Повільний + + - |
M. gordonae (M.aquae) |
Швидкість росту Відновлення нітратів Утворення пігменту в темряві Гiдролiз твiну-80 |
Повільний - + + |
M.xenopi |
Швидкість росту Відновлення нітратів Утворення пігменту в темряві Гiдролiз твiну-80 |
Повільний - + - |
M.avium |
Швидкість росту Нiацин Відновлення нітратів Гiдролiз твiну-80 |
Повільний - - - |
M.intracellulare |
Швидкість росту Нiацин Відновлення нітратів Гiдролiз твiну-80 |
Повільний - - - |
M.gastri |
Швидкість росту Нiацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 0С Утворення пігменту на світлі Гiдролiз твiну-80 |
Повільний - - - - + |
M.terrae |
Швидкість росту Нiацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 0С Утворення пігменту на світлі Гiдролiз твiну-80 |
Повільний - + - + |
M.fortuitum |
Швидкість росту Відновлення нітратів Утворення пігменту в темряві Толерантність до 5% NaCl |
Швидкий + - + |
M.smegmatis |
Швидкість росту Утворення пігменту в темряві Толерантність до 5% NaCl |
Швидкий - + |
M.phlei |
Швидкість росту Утворення пігменту в темряві Толерантність до 5% NaCl |
Швидкий + + |
Схема 3.1 - Основні тести для відрізнення М. tuberculosis, M. bovis від інших мікобактерій
Тести |
М. tuberculosis |
М.bovis |
Інші мікобактерії |
Нiациновий тест |
+ |
- |
- |
Ріст на середовищі Льовенштайна-Єнсена із 500,0 мкг/мл паранітробензойної кислоти або саліциловокислого натрію |
- |
- |
+ |
Реакція на термостабільність каталази |
- |
- |
+ |
Каталазна активність у ГІНК-резистентних штамів |
+, , - |
+, , - |
+ + + |
Схема 3.2 - Основні тести, що відрізняють M. tuberculosis від M.bovis
Тести |
M. tuberculosis |
M. bovis |
Ніацинова проба |
+ |
- |
Нікотинамідаза |
+ |
- |
Відновлення нітратів |
+ |
- |
Схема 3.3 - І група - Фотохромогенні мікобактерії
|
25 0С |
37 0С |
45 0С |
Відновлення нiтратів |
Гідроліз твiну - 80 |
M.kansasii |
+ |
± |
- |
+ |
+ |
M.simiae |
+ |
± |
- |
- |
+ |
M.marinum |
+ |
± |
- |
- |
- |
Для розрізнення всередині групи необхідні наступні тести:
Утворення пігменту, гiдролiз твiну-80, нiацинова проба (M.simiae ± ),
відновлення нітратів, ріст при 25 і 370С.
Схема 3.4 - ІІ група - Скотохромогенні мікобактерії
Штами |
25 0С |
37 0С |
45 0С |
Відновлення нiтратів |
Уреаза |
Гідроліз твiну - 80 |
M.aquae (M.gordonae) |
+ |
± |
- |
- |
+ |
+ |
M.aquae |
+ |
± |
- |
- |
- |
+ |
M.scrofulaceum |
+ |
± |
- |
- |
+ |
- |
Схема 3.5 - ІІІ група - Нефотохромогенні мікобактерії (основі тести)
|
25 0С |
45 0С |
Відновлення нiтратів |
Гiдролiз твiну-80 |
Каталаза 68 0С |
Амідазна активність |
M.avium |
± |
± |
- |
- |
+ |
Н; П |
M.intracellulare |
± |
± |
- |
- |
+ |
Н; П |
M.terrae |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
0 |
M.triviale |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Н; П; 0* |
M.xenopi |
- |
+ |
- |
- |
+ |
Н; П |
· M. terrae Вайна – 0; M.terrae Тсукамура – Н; П
· Н – нікотинамід, П – піразинамід, 0 – негативна реакція.
Схема 3.6 - І У група - Мікобактерії, що швидко ростуть (основні тести)
|
25 0С |
37 0C |
45 0C |
52 0C |
Гiдролiз твiну-80 |
M.fortuitum |
+ |
+ |
- |
- |
± |
M.phlei |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
M.smegmatis |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |