- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
1-е розведення – 25,0 мг/мл: таблетку ретельно розтирають у ступці + 1,0 мл етилового спирту. Якщо таблетка містить 250,0 мг препарату, додають 9,0 мл стерильної дистильованої води, якщо таблетка містить 500,0 мг – додають 19,0 мл води.
2-е розведення – 2,5 мг/мл (2500 мкг/мл: 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.
3-є розведення – 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.
4-е розведення (робоче) – 25,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.
Беруть 1,0 мл робочого розведення (4-го) і додають 4,0 мл середовища Проскауера-Бека, отримують концентрацію в середовищі 5,0 мкг/мл. Далі – ряд серійних розведень у середовищі до 0,07 мкг/мл. Остання пробірка без препарату (контроль).
Хід дослідження такий самий, як і при визначенні концентрації препарату в крові хворого.
Оцінка результатів. Результати досліду враховуються по інтенсивності росту плівки тест-штаму. Якщо плівка займає всю поверхню пробірки, ріст оцінюється трьома хрестами (+ + +), якщо плівка займає приблизно половину поверхні середовища – двома хрестами (+ +), якщо ріст на 1/3 поверхні середовища – одним хрестом (+). Найменша концентрація препарату, що затримала ріст плівки, і буде мінімальною інгібуючою концентрацією (МІК) цього препарату.
При обчисленні концентрації препарату в крові величину МІК препарату множать на найбільше розведення крові хворого, яке затримало ріст плівки.
Наприклад, у хворого визначають концентрацію ізоніазиду в крові після прийому разової дози препарату. Ріст плівки тест-штаму був затриманий розведенням крові 1:128, у наступному розведенні (1:256) уже був ріст плівки (+ +). Якщо МІК ізоніазиду відносно того ж тест-штаму за однакових умов дослідження (та ж партія середовища і т.п.) 0,025 мкг/мл, то концентрація ізоніазиду в крові буде: 0,025 мкг/мл х 128, тобто 3,1 мкг/мл.
5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Суть дослідження полягає в тому, що після прийому хворим будь-якого антимікобактеріального препарату кров набуває туберкулостатичної активності і при розведенні в 2, 4, 8 і т.д. раз, затримує ріст M.tuberculosis.
Про ступінь БАК судять по максимальному розведенню крові, яке ще спроможне затримати ріст M.tuberculosis. БАК залежить від ряду факторів, головним чином, від дифузійних властивостей препарату, прийнятої дози та чутливості до нього тест-штаму мікобактерій.
Дослідження проводиться за тією ж методикою, якою користуються при визначенні концентрації протитуберкульозного препарату в крові хворого (тільки не визначають при цьому МІК препарату). Кров береться після прийому разової дози препарату на передбачуваному піку його концентрації в крові, тобто при внутрішньом’язовому або внутрішньовенному введенні – через 1 годину, якщо препарат вводиться крапельним способом (фторхінолони) – в кінці крапельниці, після перорального прийому –через 2 – 3 години.
Всі препарати хворий приймає після їжі, крім рифампіцину, який приймається перед їжею.
Користуються двома способами визначення БАК. При одному з них тест-штамом, який наноситься у вигляді плівки на розведення крові хворого в живильному середовищі Проскауера-Бека, являється лабораторний штам M.tuberculosis Н37Rv, або будь-який інший штам M.tuberculosis, чутливий до всіх антимікобактеріальних препаратів. Цей спосіб має свої недоліки: при його застосуванні не враховується чутливість (чи стійкість) мікобактерій самого хворого. Тому ступінь БАК препарату може бути високою при відсутності терапевтичного ефекту від його застосування у випадку резистентності збудника до даного препарату.
Тому у випадках, коли хворий виділяє мікобактерії стійкі до якогось препарату, але все ж цим препаратом з якихось причин продовжують лікувати хворого, застосовують другий спосіб. При цьому наносять на розведення крові плівку, вирощену заздалегідь з штаму M.tuberculosis, який виділяють у даного хворого. Цей спосіб менш поширений через певні складнощі в його застосуванні: необхідно мати культуру M.tuberculosis хворого на щільному середовищі і отримати з неї плівку на рідкому середовищі, що вимагає значних затрат часу.
Хворі на туберкульоз завжди приймають комбіновану антибактеріальну терапію. Тому, особливо при дослідженні з використанням мікобактерій від самого хворого, доцільно визначати сумарну БАК, яка буде відображати істинну активність крові, що створюється після прийому кількох препаратів.
Оскільки препарати приймаються не одномоментно, а з різними інтервалами між їх прийомом, найбільш доцільно для визначення сумарної БАК брати кров 2 рази протягом дня. Перший раз – після 1-го прийому групи препаратів через 1 – 3 години. Наприклад:
1. Хворий отримав рифампіцин о 8 30 годин ранку і стрептоміцин внутрішньо-м’язово або ізоніазид внутрішньовеново об 11 00 годині. Кров при цьому треба взяти о 12-й годині.
2. Якщо рифампіцин був прийнятий о 8 30 годин ранку, а етіонамид (або інший таблетований препарат, крім піразинаміду) об 11 00 годині, то кров беруть о 13 00 – 14 00 годині.
3. Якщо хворий отримує комбінований препарат, то кров беруть через 2 – 3 години після його прийому.
Вдруге кров беруть через 2 – 3 години після прийому другої групи препаратів. Наприклад: хворий отримав ізоніазид о 15 00 годині, етамбутол о 19 00 годині; кров беруть о 21 00 годині.
У тих випадках, коли вся денна доза препаратів приймається через короткі проміжки часу, майже одночасно, перший раз кров беруть через 2 – 3 години, а другий раз – через 10 – 12 годин після прийому препаратів.
При сумарній БАК враховується синергійний вплив препаратів на збудника.
Визначення БАК відносно лабораторного штаму M.tuberculosis (або іншого чутливого до ліків штаму) доцільно застосовувати у вперше виявлених хворих, у яких передбачається чутливість збудника до антибактеріальних препаратів. Кров хворих, які раніше не лікувались, як правило, буває високоактивною, так само як і у хворих, які вже приймали антимікобактеріальну терапію, але їх M.tuberculosis все ще чутливі до препаратів. В останній групі можуть з’являтися хворі з чутливими M.tuberculosis, але з низькими показниками БАК, що в деяких випадках може пояснювати так звану клінічну медикаментозну стійкість.
Визначення БАК відносно штаму M.tuberculosis самого хворого демонструє ступінь чутливості його мікобактерій до індивідуальної БАК препаратів, яка створюється в його крові при певному режимі специфічної терапії. Данні БАК допомагають в корекції індивідуального режиму лікування.
В тих випадках, коли вже відомо, що M.tuberculosis хворого стійкі до якихось препаратів, при визначенні сумарної БАК з використанням лабораторного тест-штаму треба виключати ці препарати із тієї комбінації препаратів, що їх дають хворому безпосередньо перед дослідженням БАК.
У відповіді з лабораторії про дослідження БАК має значитись час прийому препарату і його доза (для кожного препарату окремо), час взяття крові, який і є часом показника її активності, за який приймається максимальне розведення крові, яке ще затримало ріст плівки M.tuberculosis. Наприклад, після прийому ізоніазиду хворим ріст плівки був затриманий в розведеннях крові від 1:2 до 1:128, в наступному розведенні (1:256) уже реєструється ріст плівки. Відповідь: Хворий о 8 30 прийняв 0,3 ізоніазиду. БАК об 11 00 - 1:128.
БАК вважається високою, якщо ріст M.tuberculosis затримує розведення крові 1:64 і вище, задовільною при затримці росту в розведенні крові 1:16 – 1:32, низькою при затримці росту в розведенні 1:4 – 1:8. Затримка росту тільки в розведенні крові 1:2 не розцінюється як специфічна, оскільки сама кров має певну антибактеріальну активність. В талиці 5.1 приведено середній діапазон показників БАК до кожного з антимікобактеріальних препаратів після прийому оптимальних доз при дослідженні у хворих з чутливими M.tuberculosis.
Таблиця 5.1 – Діапазон БАК після прийому одного з препаратів у хворих з M.tuberculosis, чутливих до антимікобактеріальних препаратів
Препарат |
Дози (в мг/кг), після яких досліджувалась БАК |
Через який час брали кров |
Активність крові |
Ізоніазид |
5,0 – 10,0 |
2 – 3 год |
1:64 – 1:256 |
Рифампіцин |
5,0 – 10,0 |
2 – 3 год |
1:64 – 1:256 |
Стрептоміцин |
15,0 (в/м) |
1 год |
1:32 – 1:128 |
Етамбутол |
15,0 – 20,0 |
2 – 3 год |
1:8 – 1: 32 |
Етіонамід |
10,0 – 15,0 |
2 – 3 год |
1:8 – 1: 16 |
Канаміцин |
15,0 (в/м) |
1 год |
1:16 – 1: 64 |
Офлоксацин (або ципрофлоксацин) |
7,5 – 15,0 |
2 – 3 год |
1:8 – 1: 32 |
Визначення БАК може служити допоміжним методом контролю за ефективністю застосування того чи іншого препарату, а також допомогає встановити індивідуальну активність нового препарату, який передбачається призначити хворому.
З М І С Т
Стор.
|
Інструкція з бактріологічної діагностики туберкульозної інфекції....................................................................................... |
1 |
|
ДИНАМІКА БАКТЕРІОЛОГІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ ХВОРОГО.......... |
2 |
1 |
Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу........... |
3 |
1.1 |
Харкотиння................................................................................................................ |
3 |
1.2 |
Промивні води бронхів............................................................................................. |
5 |
1.3 |
Промивні води шлунка............................................................................................. |
6 |
1.4 |
Сеча............................................................................................................................. |
6 |
1.5 |
Пунктати з закритих порожнин.............................................................................. |
7 |
1.6 |
Гній із свищів, виділення ран, менструальна кров і виділення з відкритих порожнин... |
7 |
2 |
Методи виявлення мікобактерій туберкульозу...................................................... |
7 |
2.1 |
Деякі біологічні особливості роду Mycobacterium............................................... |
7 |
2.2 |
Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу......................... |
10 |
2.2.1 |
Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем-Нільсеном..................... |
11 |
2.2.2 |
Метод збагачення...................................................................................................... |
14 |
2.2.3 |
Люмінесцентна мікроскопія..................................................................................... |
15 |
2.2.4 |
Фазовоконтрастна мікроскопія.............................................................................. |
19 |
2.3 |
Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу........................... |
19 |
2.3.1 |
Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище |
19 |
2.3.2 |
Живильні середовища............................................................................................... |
24 |
2.3.2.1 |
Приготування щільних живильних середовищ...................................................... |
25 |
2.3.2.2 |
Рідкі живильні середовища....................................................................................... |
26 |
2.4 |
Біологічний метод дослідження............................................................................... |
28 |
3 |
Ідентифікація виділених культур мікобактерій..................................................... |
29 |
3.1 |
Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження........................................ |
30 |
3.2 |
Диференціація мікобактерій..................................................................................... |
34 |
3.2.1 |
Культуральні тести.................................................................................................. |
34 |
3.2.1.1 |
Приготування середовища із саліциловокислим натрієм..................................... |
34 |
3.2.1.2 |
Приготування середовища з паранітробензойною кислотою............................. |
34 |
3.2.1.3 |
Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)......................................... |
35 |
3.2.1.4 |
Ріст на середовищі з 5 % NаСl.................................................................................. |
35 |
3.2.1.5 |
Виявлення корд-фактора.......................................................................................... |
36 |
3.2.2 |
Бiохiмiчнi методи дослідження................................................................................ |
36 |
3.2.2.1 |
Ніациновий тест........................................................................................................ |
36 |
3.2.2.2 |
Визначення амiдазної активності............................................................................ |
38 |
3.2.2.3 |
Визначення нiтратредуктазної активності............................................................. |
41 |
3.2.2.4 |
Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами....................... |
41 |
3.2.2.5 |
Реакція гiдролiзу твiну-80......................................................................................... |
43 |
3.2.2.6 |
Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій................................................ |
44 |
3.3 |
Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мікобактерій........................... |
47 |
4 |
Прискорені методи виявлення мікобактерій.......................................................... |
51 |
4.1 |
Виявлення мікобактерій за допомогою індикатоної пробірки BBL MGIT....... |
51 |
4.2 |
Визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи BBL MGIT AST SIRE................................... |
53 |
4.3 |
Виявлення мікобактерій за допомогою середовища ВКГ (стимулятор росту і середовище ВКГ)....................................................................................................... |
56 |
4.3.1 |
Постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ........... |
57 |
4.4 |
Генодіагностика: визначення вмісту ДНК M.tuberculosis і M.bovis у діагностичному матеріалі від хворих на туберкульоз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)................................................................. |
60 |
5 |
Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів................................................................................................................... |
69 |
5.1 |
Критерії стійкості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів................................................................................................................... |
69 |
5.1.1 |
Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах........ |
71 |
5.1.1.1 |
Розведення антимікобактеріальних препаратів..................................................... |
71 |
5.1.2 |
Визначення стійкості МБТ до антимікобактеріальних препаратів методом пропорцій (метод Канетті)....................................................................................... |
74 |
5.3 |
Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів......................................................................... |
79 |
5.4 |
Визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища.................................................... |
80 |
5.5 |
Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих ........ |
81 |
5.5.1 |
Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі.............................................. |
82 |
5.5.1.1 |
Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення МІК ... |
83 |
5.5.1.2 |
Визначення бактеріостатичної активності крові (БАК) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)......................... |
85 |
|
Зміст............................................................................................................................ |
89 |
|
Додаток до Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції (Форми медичної облікової документації, що використовуються в мікробіологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів (Витяг з Наказу Головного Управління охорони здоров’я № 13 від 22.01.2001 р............ |
91 |