- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
Кров’яне середовище.
Для прискореного виявлення в патологічному матеріалі M.tuberculosis в виключних випадках використовують метод Прайса, оснований на мікрокультивуванні мікобактерій на предметних скельцях, а також в глибині рідкого середовища (в модифікації Є.А.Школь-нікової). Цей метод дає можливість виявити мікроколонії M.tuberculosis уже через 2 – 10 діб після посіву.
Досліджуваний матеріал після обробки переносять піпеткою в центрифужну пробірку і центрифугують 1-2 хвилини. З осаду готують мазки на стерильних вузьких скельцях, які отримують, розрізуючи предметне скло вздовж на 2 частини. Можна робити мазки безпосередньо з грудочок харкотиння. Мазки роблять на 1/3 частини скельця, яке укладають в стерильну кювету, підсушують в термостаті при 37 0С протягом кількох годин, потім заливають на 1-2 хвилини 3,0 % розчином сірчаної кислоти для деконтамінації і фіксації. Після зливання кислоти мазки тричі відмивають стерильною водою і занурюють у пробірки з живильним середовищем. Як живильне середовище використовується свіжа цитратна гемолізована донорська кров, термін придатності якої для росту мікобактерій – не більше 10 діб. Кров від донора збирається в стерильну колбу з 5,0 % розчином цитрату натрію (на 100,0 мл крові 10,0 мл цитрату). Цитратна кров гемолізується стерильною дистильованою водою в співвідношенні 1:10 – 1:5 (в залежності від дати взяття крові). Гемолізована кров над полум’ям пальника розливається по 5,0 мл у стерильні пробірки.
Облік результатів проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 0С. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують, обережно відмивають водою від крові, підсушують, фіксують над полум’ям, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії, що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути, так звані “коси”, які складаються з великої кількості щільно притиснутих одна до одної клітин, їх можна побачити, перевівши об’єктив на імерсійну систему. Корд-фактор (тригалоза–6,6–диміколат), що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних “кіс” і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити, що предметне скельце повинно бути лише новим, без подряпин, добре відмитим, обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим.
Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
Застосовується для мікрокультивування M.tuberculosis в глибині рідкого середовища.
Склад. Сольовий розчин: калій фосфорнокислий однозаміщений – 1,5 г, натрій фосфорнокислий двозаміщений – 2,5 г, магній сірчанокислий – 0,5 г, натрій лимоннокислий – 1,5 г, лимоннокислоаміачне залізо – 0,05 г, L-аспарагін – 1,0 г, гліцерин – 30,0 мл, вода дистильована до 1000,0 мл. Нативна бичача сироватка. Пеніцилін.
Техніка приготування. Солі у вказаному порядку додають у дистильовану воду при легкому нагріванні на водяній бані (кожну із солей додають після того, як повністю розчиниться попередня). Середовище фільтрують через паперовий фільтр і розливають у колби, стерилізують в автоклаві при 0,5 атм. протягом 30 хвилин. В такому стані можна зберігати в холодильнику кілька місяців.
Для посіву сольовий розчин розливають у пробірки по 2,0 мл, знову автоклавують і безпосередньо перед посівом у кожну пробірку додають по 0,2 мл нативної бичачої сироватки і пеніцилін із розрахунку 10 –20 ОД на 1,0 мл середовища.
Середовище ВКГ (розроблено В.В.Власенко) (середовище зі стимулятором росту для прискореного виявлення мікобактерій туберкульозу).
Середовище ВКГ призначене для прискореного виявлення M.tuberculosis: стимулятор - для прискорення росту, живильне середовище - для культивування мікобактерій. Стимулятор росту - стерильна, прозора, безбарвна рідина (допускається жовтуватий відтінок).
До 5,0 мл стимулятору росту додають в асептичних умовах за допомогою стерильного шприця 1,0-1,5 мл підготовленого патологічного матеріалу (відбір і підготовка матеріалу здійснюється за загальноприйнятою методикою бактеріологічних досліджень та чинної методичної НД). Отриману суспензію інкубують у термостаті при температурі (37,0 1,0) 0С протягом 24 - 48 годин і висівають на живильне середовище.
Живильне середовище (дрiбнодисперсний, гігроскопічний порошок кремового кольору) у кількості, зазначеній на етикетці, розмішують в 1,0 л стерильної дистильованої води, кип’ятять 2-3 хвилини до повного розплавлення агару, фiльтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, стерилiзують у автоклаві при (121,0 1,0) 0С протягом 15 хвилин.
Готове середовище жовтого забарвлення з рН 7,2 0,2, використовують протягом 1 місяця за умови зберігання його при (6,0 2,0) 0С.
Перед посівом живильне середовище розплавляють на водяній бані і розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6-8 мм. В чашку Петрі зі свіжорозплавленим живильним середовищем вносять 1,5 мл суспензії (досліджуваного матеріалу у стимуляторі росту), рівномірно розподіляючи її по всій поверхні. Чашки Петрі не перевертають !!!, герметизують прозорою липкою стрічкою та інкубують при (37,0 1,0) 0С протягом 10 діб. Посіви продивляються щоденно. Візуально можна виявити характерний ріст мікобактерій уже через 24 - 48 годин.