- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
Фазовоконтрастна мікроскопія є єдиним мікроскопічним методом дослідження, що дозволяє спостерігати клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми в живому стані. Для її здійснення до звичайного світлового мікроскопу застосовується спеціальне фазовоконтрастне пристосування КФ-4.
З методів фазовоконтрастної мікроскопії найбільше широко застосовується методика дослідження препаратів, приготовлених по типу препарату, що одержав назву «роздавлена крапля». Для готування даного препарату беруть чисте знежирене предметне скельце. На поверхню його бактеріологічною петлею чи піпеткою наносять краплю рідкої суспензії досліджуваних мікобактерій чи їх біологічно змінених форм, покривають краплю чистим і фламбірованим над полум’ям пальника покривним скельцем так, щоб між предметним і покривним скельцем не було пухирців повітря. Препарат поміщають на предметний столик мікроскопа і відповідно до правил здійснюють фазовоконтрастну мікроскопію. При цьому в полі зору мікроскопа стають помітними живі клітини мікобактерій чи їх біологічно змінені форми. Для фазовоконтрастної мікроскопії імерсійним методом на поверхню покривного скельця наносять краплю імерсійної олії, занурюють у неї імерсійний об’єктив і здійснюють мікроскопію. При цьому у полі зору спостерігають живі клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми, окремі деталі їх структури.
2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
Бактеріологічний метод виявлення мікобактерій має великі переваги перед методом бактеріоскопії. Він дозволяє виявити M.tuberculosis в досліджуваному матеріалі, якщо їх міститься біля 100 в 1 мл. Зрілі культури можуть бути ретельно досліджені й ідентифіковані, у них може бути визначена чутливість до антимікобактеріальних препаратів, вивчена вірулентность та інші властивості. Виділення мікобактерій бактеріологічним методом свідчить про високу життєздатність мікобактерій і вегетування їх в організмі хворого.
2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
Бактеріологічному дослідженню піддається самий різноманітний матеріал: харкотиння, промивні води бронхів, шлунка, ексудат, виділення ран, сеча, ліквор, біопсійний і секційний матеріал і ін. Матеріал повинен доставлятися в лабораторію в стерильному, добре закритому посуді.
Для знищення супутньої мікрофлори досліджуваний матеріал піддають спеціальній обробці. Для обробки патологічного матеріалу використовують різні речовини. Основні вимоги, що пред'являють до таких реактивів, це, з одного боку, повне зберігання життєздатності M.tuberculosis, а з іншого, пригнічення росту неспецифічної мікрофлори, яка може бути в досліджуваному матеріалі. Для практики можуть бути рекомендовані наступні методи обробки патологічного матеріалу.
Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
Цей метод є найбільш зручним і поширеним.
Принцип. Трьохзаміщений фосфат натрію є реактивом, який не впливає на життєздатність туберкульозних паличок. Цей метод лужної обробки допускає навіть тривалу експозицію патологічного матеріалу з фосфатом натрію без порушення життєздатності M.tuberculosis (2-3 доби). Це особливо цінно в тих випадках, коли доставка матеріалу в лабораторію утруднена. Крім того, трьохзаміщений фосфат натрію добре пригнічує супутню мікрофлору і гомогенізує матеріал. Обробці трьохзаміщеним фосфорнокислим натрієм піддають харкотиння, промивні води бронхів, ексудати і будь-які інші матеріали.
Реактиви
12,0 % стерильний водний розчин Nа3 РО4 (автоклавування при 121 0С 1-2 хв.).
Обробка полягає в додаванні до досліджуваного матеріалу рівної за об’ємом кількості 12,0 % розчину трьохзаміщеного фосфату натрію й інкубації цієї суміші при 37 0С у термостаті протягом доби. Після інкубації матеріал центрифугують 15 хвилин при 3500 об/хв., надосадну рідину зливають, до осаду додають 1,0 мл фізіологічного розчину і засівають по 0,2 мл на 2 пробірки щільного яєчного середовища.
Обробка фосфатом натрію зручна і тоді, коли харкотиння для посіву треба доставляти в лабораторію здалека. У цьому випадку хворий протягом доби збирає харкотиння в стерильну кишенькову плювальницю з 10,0 мл 12,0 % розчину фосфату натрію, який служить консервантом. При доставці харкотиння в лабораторію вміст плювальниці переливають у стерильні пробірки, центрифугують, надосадну рідину зливають, а осад засівають звичайним способом.