II Приготування суспензії культури мбт

Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0,9 % розчині NaCl. Для цього культуру, що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному 0,9 % розчині NaCl, при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку, що містить 2,0 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl, культуру змивають в рідину, попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури.

Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 1 McF. Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, відсмоктують піпеткою в іншу пробірку з 0,9 % розчином NaCl.

З цієї суспензії готуються наступні розведення:

- 1:10 (0,9 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,1 мл суспензії);

- 1:100 - контроль 1 (К₁) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл розведення1);

- 1:1000 - контроль 2 (К₂) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл К₁);

- 1:10000 - контроль 3 (К₃) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл К₂).

Пробірки маркірують.

З кожної пробірки (К₁, К₂, К₃) робиться висів бактеріальної суспензії в кількості 100,0 мкл (0,1 мл) на середовище Льовенштайна-Єнсена. Це контрольні пробірки.

З розведения 1:100 = К₁ по 100,0 мкл (0,1 мл) суспензії культури засівається на пробірки з середовищем Льовенштайна-Єнсена, що містять вказані вище концентрації препаратів. Пробірки маркірують і поміщають в горизонтальному положенні в термостат при 37 ⁰С, наступного дня перекривають стерильними гумовими корками для запобігання висихання середовища і ставлять вертикально.

Посіви проглядають щотижня. Через 2-4 тижні після посіву, максимум через 6 тижнів, реєструють отримані результати.

Оцінка результатів.

При обліку результатів за методом Канетті кількість колоній, що виросли в контрольній пробірці К₁(вихідне розведення мікробної суспензії1:100) приймається за 100 %; кількість колоній, що виросли в К₂ відповідає 10 % усієї бактеріальній популяції; кількість колоній, що виросли в К₃ відповідає 1 % бактеріальної популяції.

Якщо в контрольних пробірках К₁, К₂, К₃ при посіві досліджуваного штаму МБТ спостерігається ріст відповідно до вищезгаданих пропорцій, можна робити облік результатів стійкості в пробірках з препаратами. При цьому в К₃ повинно бути більше 30 і не більше 100 колоній. Інтенсивність росту в контролях і в пробірках з препаратами оцінюється в такий спосіб:

	- до 10 колоній;
1 +	- 10-20 колоній;
2 +	- 20-100 колоній, між колоніями можна бачити острівці середовища;
3 +	- більше 100 колоній.

Культура МБТ є “чутливою”, якщо в пробірці з “критичною” концентрацією препарату немає росту, або спостерігається до 10 колоній, тобто менше 1 % бактеріальної популяції.

Культура МБТ є “стійкою”, якщо в пробірці з “критичною” концетрацією препарату спостерігається більше 10 колоній, тобто більше 1,0 % бактеріальної популяції.

Дослідження потрібно повторити, якщо:

- немає пропорційності росту між К₁, К₂, К₃;

- К₃ - негативний або виросло менше 30 колоній;

- К₁, К₂, К₃ або один з них забруднено;

- забруднені пробірки з препаратами.

Результати визначення резистентності вносяться в таблицю:

Дослідження мікобактерій на чутливість до антимікобактеріальних препаратів

Концентрація в живильному середовищі (мкг/мл)		0,2		0,5		1,0	2,0	4,0			8,0			16,0			20,0			32,0	40,0	Оцінка
Ізоніазид (INH)
Рифампіцин (RMP)
Стрептоміцин (SM)
Етамбутол (EMB)
Протіонамід (PTH)
Амід нікотинової кислоти (NSA, г/л)
Контролі	Позначення результату:																		Оцінка росту:
1........................	- Ч - чутливі;																		- 3+ - більше 100 колоній;
2........................	- С - стійкі.																		- 2+ - 20-100 колоній;
3........................																			- 1+ - 10-20 колоній;
																			- - до 10 колоній.

Примітка:  - позначені критичні концентрації препаратів в середовищі Льовенштайна-

Єнсена.