4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire

Система BBL MGIT AST SIRE являє собою швидкодіючий ручний якісний метод визначення чутливості M.tuberculosis до стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу.

Принцип. Індикаторна пробірка BBL MGIT для визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis представляє собою таку ж пробірку, як і у випадку для виявлення росту мікобактерій. Система BBL MGIT AST SIRE призначена для якісного аналізу протягом 3 – 14 днів. Цей аналіз грунтується на рості штаму M.tuberculosis в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, при порівнянні з пробіркою без препаратів. Спостереження за пробірками MGIT здійснюють щодня, починаючи з третьої доби після інокуляції. Відсутність флюоресценції в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, через дві доби після появи флюоресценції в контрольній пробірці, свідчить про чутливість M.tuberculosis до даного антимікобактеріального препарату. Флюоресценція в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, через дві доби або протягом двох діб після появи флюоресценції в контрольній пробірці, свідчить про стійкість мікобактерій до дії даного препарату.

Реактиви.

Комплект ВВL MGIT AST SIRE містить по дві ліофілізовані ампули стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу.

Вміст в 1 ампулі ліофілізованого стрептоміцину – 160,0 мкг, ізоніазиду – 20,0 мкг, рифампіцину – 200,0 мкг, етамбутолу – 700 мкг.

Хід дослідження. В кожну ліофілізовану ампулу BBL MGIT з препаратом додати по 4,0 мл стерильної дистильованої води для отримання основних розведень препаратів: 40,0 мкг/мл для стрептоміцину, 5,0 мкг/мл для ізоніазиду, 50,0 мкг/мл для рифампіцину, 175 мкг/мл для етамбутолу.

Для визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням BBL MGIT необхідно попередньо виділити чисту культуру бактерій на щільному живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена або Фінна-2.

Далі слід приготувати суспензію M.tuberculosis.

1. Додати 4,0 мл BBL бульйону 7Н9 Міддлбрука в стерильну пробірку розміром 16,5 х 128 мм з ковпачком, яка містить 8 – 10 скляних кульок.

2. Зняти стерильною лопаткою з щільного живильного середовища якомога більше колоній, намагаючись не зачіпити середовище. Суспендувати колонії в бульйоні 7Н9 Міддлбрука. Каламутність суспензії повинна перевищувати стандарт Макфарленда 1.0.

3. Збовтувати суспензію в змішувачі протягом 2 – 3 хвилин, для того щоб розбити більш крупні грудочки.

4. Залишити суспензію відстоюватися на 20 хвилин.

5. Надосадну рідину перенести в іншу стерильну пробірку розміром 16,5 х 128 мм з ковпачком (уникати переносу будь-якої частини осаду) і залишити відстоюватися ще на 15 хвилин.

6. Перенести надосадну рідину (вона повинна бути однорідною, без грудочок) в третю пробірку.

7. Довести суспензію до стандарту Макфарленда 0.5.

8. Розвести 1,0 мл суспензії в 4,0 мл стерильного ізотонічного розчину (розведення 1:5). Інокулят готовий.

Для контрольної пробірки з негативним результатом використовується закрита не інокульована пробірка MGIT.

Позитивний контроль – пробірка MGIT, з якої видалено бульйон Міддлбрука і стерильно внесено 5,0 мл 0,4 % розчину сульфату натрію. Пробірку щільно закривають ковпачком і залишають при кімнатній температурі на 1 годину.

Контрольні пробірки не інкубують в термостаті. Їх можна використовувати багаторазово, але не більше 4 тижнів, в умовах зберігання при кімнатній температурі.

Методика інокуляції для визначення чутливості M.tuberculosis.

1. Промаркірувати пробірки MGIT STR, MGIT INH, MGIT RIF, MGIT EMB, GC –контроль росту, а також на пробірках відмітити номери проб.

2. В асептичних умовах додати в кожну пробірку 0,5 мл MGIT OADC.

3. В асептичних умовах перенести мікропіпеткою по 100,0 мкл основних розведень антимікобактеріальних препаратів (STR, INH, RIF, EMB) в промаркіровані пробірки MGIT. В пробірку MGIT GC не додавати ніяких антибіотиків.

4. Інокулювати піпеткою 0,5 мл суспензії у співвідношенні 1:5 (див. “Приготування проби”) в кожну з п’яти пробірок MGIT.

5. Інкубувати пробірки MGIT при 37 ⁰С.

Облік показань пробірок MGIT.

1. Витягти пробірки MGIT з термостата на третій день після інокуляції і врахувати показання за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла.

Примітка. Необхідно враховувати показання пробірок AST щодня, починаючи з третього дня, до тої пори, поки не з’явиться можливість інтерпретувати результати.

2. Порівняти пробірку MGIT GC з контрольними пробірками К^- і К⁺. Контрольна пробірка К⁺ повинна давати сильну флюоресценцію (яскравого жовтогарячого кольору на дні пробірки, а також відображення жовтогарячого кольору на меніску). Контрольна пробірка К^- повинна давати дуже незначну флюоресценцію.

3. Якщо флюоресценція в пробірці MGIT GC більше схожа на флюоресценцію в К⁺, ніж в К^-, то має місце ріст мікобактерій. Як тільки в пробірці MGIT GC з’явиться позитивний результат, її використовують для інтерпретації результатів, отриманих в пробірках, які містять антимікобактеріальні препарати.

Інтерпретацію результатів в пробірках, що містять препарати, проводять в той же день, коли був отриманий позитивний результат в пробірці MGIT GC, та протягом ще двох додаткових днів.

4. Якщо пробірка MGIT GC не дає флюоресценції і більше схожа на К^-, повторно інкубувати пробірки і продовжувати враховувати щодня на протязі 12 днів після інокуляції всіх пробірок. Якщо результат в пробірці MGIT GC двоїстий (важко визначити, присутня або ні флюоресценція жовтогарячого кольору), тоді слід вважати результат негативним і повторно інкубувати пробірку.

5. Якщо пробірка MGIT GC не дає позитивного результату на 12 день досліджень, це дослідження вважається недійсним.

Інтерпретація результатів досліджень.

Інтерпретувати результат, отриманий в пробірці MGIT, як чутливість, якщо пробірка, яка містить лікарський препарат, не дає флюоресценції протягом двох днів після появи флюоресценції в пробірці MGIT GC.

Інтерпретувати результат, отриманий в пробірці MGIT, як стійкість, якщо флюоресценція в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, виникає на другу добу або протягом двох днів після появи флюоресценції в пробірці MGIT GC.

Результати досліджень не піддаються інтерпретації, якщо в пробірці з контролем росту (MGIT GC) флюоресценція не виникає протягом 12 днів після інокуляції.

Таблиця 4.1 – Концентрації медикаментозних препаратів в пробірках MGIT

Лікарський препарат	Концентрація антимікобактеріаль-них препаратів після розведення (мкг/мл)	Об’єм, доданий в пробірки MGIT для досліджень (мкл)	Кінцева концентрація в пробірках MGIT (мкг/мл)
MGIT STR	40,0	100,0	0,8
MGIT INH	5,0	100,0	0,1
MGIT RIF	50,0	100,0	1,0
MGIT EMB	175,0	100,0	3,5