3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй

Крім широкого використання для диференціації культур біохімічних тестів, при встановленні видової належності культур користуються біологічним методом.

Відомо, що чутливість експериментальних тварин до M.tuberculosis, M.bovis i M.avium - різна. Тому в лабораторній практиці експериментальні дослідження проводять на морських свинках, кроликах, білих мишах і курах.

Для зараження морських свинок під шкіру користуються двома дозами: 0,1 мг і 0,01 мг; кроликів - внутрішньовенно 0,1 мг і 0,01 мг і білих мишей - внутрішньовенно дозою 0,1 мг. Кур заражають у вену крила 0,1 мг і 1,0 мг.

М.tuberculosis, чутливі до препаратів ГІНК, призводять до загибелі морських свинок до 2-3-х місяців і білих мишей до 20-30-ої доби. На секції у свинок - картина важкого генералізованого туберкульозу з ураженням внутрішніх органів і лімфатичних вузлів, у білих мишей - ураження легень.

М.bovis викликають загибель кроликів до 1,5-2-х місяців із ураженням нирок, легень, а також морських свинок (приблизно через 2 місяці) і білих мишей ( на 20-30-у добу).

M.avium призводять до загибелі курей (на 30-50-у добу), кроликів (на 20-40-у добу), а у білих мишей викликають ураження легень, печінки і збільшення селезінки. У свинок відзначається лише інфільтрат під шкірою на місці введення культури, а іноді - невелике збільшення регіонарних лімфатичних вузлів. Варто пам’ятати, що у курей і кроликів туберкульозні ураження на органах частіше всього відсутні. На секції у кур видно різко збільшену печінку, а у кроликів - також і селезінку.

Підтвердженням того, що причиною загибелі тварин були М.avium, є мазки-відбитки з печінки, селезінки і кісткового мозку. У препаратах виявляється значна кількість поліморфних кислотостійких мiкобактерiй.

Ідентифікація мiкобактерiй туберкульозу по культуральним, біохімічним і біологічним методам надана в табл.3.5 (на стор. 50).

Таким чином, для відрізнення мiкобактерiй туберкульозу від інших кислотостійких мiкобактерiй використовують комплекс ознак: культуральні властивості, відсутність здатності до росту на яєчному середовищі з паранітробензойною кислотою або саліциловокислим натрієм, здатність до утворення корд-фактору, термолабiльнiсть каталази та й ін.

Перераховані ознаки відрізняють M.tuberculosis від атипових мiкобактерiй.

Атиповi мiкобактерiї в більшості випадків не патогенні для лабораторних тварин. Патологічні зміни в органах можуть бути отримані в більшості випадків при внутрішньовенному або внутрішньочеревинному зараженні морських свинок, кроликів і мишей великими дозами бактерій (1,0 мг і більше). На практиці для відрізнення непатогенних мiкобактерiй від туберкульозних можна користуватися внутрішньошкірним зараженням морських свинок введенням зависі 0,1 мг мiкобактерiй у 0,2 мл фізіологічного розчину.

На введення М.kansasiі, M.scrofulaceum, М. intracellulare, М. аvium і деяких інших розвивається виразка, яка самозагоюється, на відміну від генералізованого процесу, що виникає при внутрішньошкірному введенні M.tuberculosis i M.bovis.

При вивченні виділених штамів зустрічаються певні труднощі. Може мати місце одночасне виділення типових і атипових мiкобактерiй. У такому випадку, значення має кратність виділення атипових мiкобактерiй, рясність росту. Особливої уваги заслуговують випадки повторного виділення тільки атипових мікобактерій при відсутності типових. Питання про значення їх у етиології захворювання вирішується на підставі комплексу клініко-рентгено-бактеріологічних досліджень.

З усіх приведених методів дослідження жодний, сам по собі, не може відповісти на запитання про належність штаму до одного із видів. Тільки комплексне застосування ряду бактеріологічних, біохімічних, біологічних методів дослідження дає можливість правильно ідентифікувати виділені культури. При ідентифікації мiкобактерiй перед мікробіологами встають наступні питання: чи є виділені мiкобактерiї туберкульозними, і до якого виду вони належать.

Якщо виділяються культури, відмінні від туберкульозних, то необхідно уточнити, чи відносяться вони до атипових, і до якої групи по Раньону. В залежності від лабораторії, що обслуговує туберкульозні заклади, об’єм тестів, що використовуються при ідентифікації мiкобактерiй, підрозділяється на більш прості і доступні для кожного практичного закладу і більш детальні, що включають ряд біохімічних і біологічних досліджень. Останні проводяться у лабораторії при обласному протитуберкульозному диспансері. 1-й комплекс досліджень включає наступні найбільш прості тести, на підставі яких вирішується питання про належність штаму до туберкульозних або атипових мікобактерій:

- швидкість росту;

- утворення пігменту;

- каталазо-пероксидазна активність;

- термостабiльнiсть каталази;

- ріст на середовищі з пара-нітробензойною кислотою;

- первинна медикаментозна стійкість.

2-й комплекс досліджень включає додаткові бактеріологічні і бiохiмiчнi тести: ріст у мікрокультурах, утворення нiацину, ациламідна активність, гiдролiз твiну-80 і докладне вивчення культуральних і біологічних властивостей.

Бiохiмiчний метод ідентифікації мiкобактерiй у сполученні з культуральним є швидким, доступним і надійним. Він повинен широко застосовуватися в бактеріологічних лабораторіях.

У таблиці 3.6 подана ідентифікація ряду видів мiкобактерiй за комплексом бактеріологічних і біохімічних тестів (на стор.50).

Таблиця 3.5 - Ідентифікація мiкобактерiй туберкульозу культуральними, біохімічними, біологічними методами

Види

Ріст пасажних культур на різних середовищах при різних температурах

Морфлогія

Колір

Бiохiмiчнi тести

Вірулентність для тварин

мiкобактерiй

Яєчне середовище

Середовище Школьнікової

Агар гліцериновий

колоній

колоній

Нiациновий тест

Каталаза

Відновлення нітратів

Нiкотинамiдазна активність

Корд-фактор

Морські свинки

Кролики

Миші

Кури

250С

370С

450С

370С

250С

370С

M.tuberculosis

-

+

-

+ груба плівка

-

-

R

Кремовий

+

+ + *

+

+

+

+

-

+

-

M.bovis

-

+

-

+ тонка плівка

-

-

RS

Білий (сірий)

-

+ + *

-

-

+

+

+

+

-

M.avium

-/+

+

+

+ придоний ріст

-

-

S

Кремовий

-

+ + +

-

-

-

±

+

+

+

Позначення: + ростуть, - не ростуть, -/+ деякі культури ростуть; + реакція позитивна, - реакція негативна; + вірулентні, ± слабо вірулентні, - не вірулентні.

( у чисельнику - більшість штамів, у знаменнику - меншість); * - у штамів, чутливих до ізоніазиду.

Таблиця 3.6 - Ідентифікація кислотостійких мiкобактерiй бактеріологічними і біохімічними тестами

М І К О Б А К Т Е Р I Ї

Тести

Туберкульозні

А Т И П О В І

І група

ІІ група

ІІІ група

ІУ група

M.tuberculosis

M.bovis

M.kansasii

M.marinum

M.scrofulaceum

M.gordonae

M.avium

M.intracellularae

M.xenopi

M.terrae

M.triviale

M.fortuitum

M.phlei

M.smegmatis

Швидкість росту

Повільн.

Повільн.

Повільн.

Повільн.

Повільн.

Медл.

Повільн.

Повільн.

Повільн.

Повільн.

Повільн.

Швидко

Швидко

Швидко

Нiацин

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Утворення пігменту у темряві

-

-

-

-

+

+

-

-

-/+

-

-

-

+

-/+

Утворення пігменту на світлі

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Каталазна активність

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Пероксидазна активність

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Термостабiльнiсть каталази 680

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Гiдролiз твiну 80

-/+

-

+

+

-

+

-

-

-

+

+

+/-

+

+

Відновлення нітратів

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

Уреаза

+

+

+

+

+

-/+

-

-

-

-

-

+/-

+

+

Нiкотинамiдаза

+

-

+

+

+

-

+

+

+

-/+

-

+/-

+

+

Пiразинамiдаза

+

-/+

-/+

+

+

-

+

+

+

-/+

-

+/-

+

+

Ріст на середовищі з 5% NАСl

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл саліцил. натрію

-

-

+/-

+/-

+

+

+/-

+/-

+/-

+

+

+

+

+

Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл паранітробенз. кислотою

-

-

+/-

+/-

+

+

+/-

+/-

+/-

+

+

+

+

+

Ріст на середовищі з 2 мкг/ мл тібону

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Утворення корд-фактору

+

+

-/+

-/+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Ріст на середовищі Л.-Й. 22-250С

-

-

+/-

+

+

+

-/+

+/-

-

+

+

+

+

+

То ж 37-380С

+

+

+

+/-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

То ж 450С

-

-

-

-

-

-

+/-

-/+

-/+

-

-

-

+

+

Ріст на агарі 220С

-

-

-

-

-/+

+/-

-

-

-

-

-

+

+

+

То ж 370С

-

-

-

-

+/-

+/-

-

-

-

-

-

+

+

+

Позначення:

Для росту на середовищі: + ріст усіх культур, - ріст вiдсутнiй, +/- більшість культур дають ріст, -/+ більшість культур не дає росту.

Для утворення пігменту: + культури утворюють пігмент, - культури не утворюють пігмент, -/+ окремі культури утворюють пігмент.

Для біохімічних реакцій: + реакція позитивна, - реакція негативна, +/- більшість культур дають позитивну реакцію, -/+ більшість культур дають негативну реакцію.