- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Визначення формамiдазної активності
Для штамів кислотостійких сапрофітів, що швидко ростуть (ІУ група), характерною є наявність формамiдазної активності. Цей фермент вiдсутнiй у M.tuberculosis й у більшості атипових мiкобактерiй, які класифіковані за Раньоном.
Принцип реакції полягає в здатності формамідази розщеплювати формамід з утворенням аміаку, виділення якого уловлюється в реакції з фенолом і гіпохлоритом.
Хід дослідження (модифікована методика Дихно) аналогічний реакції на нiкотинамiдазу. Використовується 0,2 мл формаміду на 250,0 мл дистильованої води. Для проведення реакції необхідно мати інгредієнти високої якості.
3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
При диференціюванні мiкобактерiй туберкульозу користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати M.tuberculosis, які мають нiтратредуктазу, від M.bovis, M.avium і від деяких атипових, у яких цей фермент вiдсутнiй. Виняток складають фотохромогенні мiкобактерiї (М. kansasii) і деякі з III і IV груп.
Принцип. Активність нiтратредуктази визначається по кількості відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.
Реактиви.
1. 0, 067 М фосфатний буфер (рН-7, 1), що містить 0,1 % нітрату натрію.
2. 2,0 % pозчин (вага/об’єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % НСl.
3. 10,0 % розчин соляної кислоти.
Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.
Хід дослідження. 50,0 мг вологої ваги 3 - 4-тижневої культури суспендують в 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН - 7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, і iнкубують при З7 0С 15 - 16 годин. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % pозчину пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % НСl + 1,0 мл 10,0 % НСl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до M.tuberculosis (метод Тсукамура).
Крім активності вказаних ферментів для відрізнення M.tuberculosis від інших кислотостійких мiкобактерiй можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.
3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
У окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь приймають такі ферменти, як каталаза і пероксидаза. У M.tuberculosis і M.bovis, чутливих до препаратів групи ГІНК (гідразиду ізонікотинової кислоти), виявляється активність обох ферментів паралельно. При цьому у чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню, обумовлене діяльністю каталази, і забарвлення колоній у темно-коричневий колір, обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази. У культур M.tuberculosis, стійких до препаратів групи ГІНК, активність цих ферментів різко знижена, при визначенні каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості, повільно або майже відсутні, а при визначенні активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються, або (при високому ступені стійкості до ізоніазиду) залишаються безбарвними. На відміну від M.tuberculosis, у атипових мiкобактерiй, незалежно від стійкості до ГІНК, каталазна активність завжди різко позитивна, пероксидазна ж, як правило, не виявляється.