- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Атипові мікобактерії
В даний час атипові мікобактерії привертають все більшу увагу бактеріологів і клініцистів. Зростаюча роль атипових мікобактерій в патології людини деякою мірою пов’язана з неправильним застосуванням антибіотиків, атипові мікобактерії характеризуються широким спектром медикаментозної стійкості і потенційною патогенністю для людини і тварин.
При виділенні з патологічного матеріалу хворих атипових мікобактерій важливо встановити значення їх у патології. Особливої уваги заслуговують випадки повторного виділення з патологічного матеріалу атипових культур при відсутності в досліджуваному матеріалі M.tuberculosis. Атипові мікобактерії відрізняються від M.tuberculosis рядом ознак в залежності від їх таксономічної належності. Для систематизації атипових мікобактерій користуються угрупуванням Раньона, заснованим, головним чином, на двох ознаках - швидкості росту і пігментоутворенні. За цим угрупуванням всі атипові мікобактерії розділені на 4 групи. Представники перших 3-х груп ростуть повільно. 4-ї групи ростуть швидко. Найбільш патогенні для людини мікобактерії I і III груп.
I група - фотохромогенні мікобактерії: М. kansasii, M.marinum (М.balnei), М. simiae, M.szulgai. Кислотостійкі палички; при культивуванні звичайно утворюють жовто-жовтогарячий пігмент; колонії виростають протягом 2 тижнів при температурі 37 0С і протягом 3 тижнів - при кімнатній температурі. При культивуванні на світлі пігментоутворюючі штами дають більш інтенсивне червоно-жовтогаряче забарвлення колоній. Молоді клітини довгі і порівняно широкі, розташовуються стрічками; утворюють S- і R-колонії. Типовий вид – M.kansasii.
М. kansasii. Утворюють пігмент (кристали -каротину) тільки при рості на світлі. По ступеню шорсткості колоній штами варіюють від SR до RS, але можуть бути повністю шорсткуватими (R). Для ідентифікації кристалів каротину рекомендується вивчення колоній під малим збільшенням (30-100), їхня наявність – чітка ознака, що відокремлює М.kansasii (а також M.marinum) від інших видів. У людини викликають туберкульозоподібні ураження легень, найбільш часто спостерігають шийні лімфаденіти (скрофули) і ураження шкіри, рідше, особливо в ослаблених пацієнтів, дисеміновані ураження.
M.marinum. Частіше утворюють S-колонії, відмінна риса – прискорений ріст при температурі 30-33 0С і повна його відсутність при 37-40 0С. Швидкість росту у різних штамів варіює від 5 до 15 діб. До 30,0 % штамів дають слабо позитивний ніациновий тест. У людини найбільш часто викликає ураження верхніх і нижніх кінцівок.
II група - скотохромогенні мікобактерії: M. scrofulaceum; M.aquae (М.gordonae) - M.aquae I типу –“водопровідні мікобактерії”, M.aquae II типу – M.gordonae; M.flavescens . Варіабельні кислотостійкі палички, частіше утворюють S-колонії, плоскі чи з гострою верхівкою, у пігментоутворюючих штамів колонії забарвлені в жовто-жовтогарячі тони, незалежно від культивування на світлі чи в темряві (забарвлення на світлі більш інтенсивне).
M. scrofulaceum. Умовно-патогенні мікобактеріі, що повільно ростуть, через 2 тижні утворюють жовті колонії. Мікроколонії округлі, утворені безладно розташованими паличками (як купка висипаних сірників). Викликають у дітей ураження лімфовузлів і легень. За характером росту і морфологією нагадують сапрофіти M.aquae (М.gordonae) і M.flavescens. Для їхньої диференціальної діагностики звичайно використовують тести стійкості до 5,0 % розчину NaCl, гідролізу твін-80 і відновлення нітратів, а також амідазний тест, що диференціює M.aquae I типу («водопровідні» мікобактерії) і M.aquae II типу (M.gordonae).
ІІІ група - нефотохромогенні мікобактерії: М.avium, M.intracellulare, M.xenopi, M.haemophilum.
Видимий ріст культур виявляється вже через 5 – 10 діб і більше, звичайно утворюють кремові, іноді напівпрозорі, гладенькі S-колонії, що добре емульгуються у воді. При старінні культур колонії деяких штамів можуть набувати жовтогарячого забарвлення (пігментація не залежить від експозиції на світлі). Ніациновий тест негативний.
М.avium. Викликає до 3,0 % захворювань на туберкульоз людини. Морфологічно і культурально аналогічна M.intracellulare і утворює з нею комплекс avium-intracellulare. Морфологічно представлені тонкими, слабо гіллястими паличками, мікроколонії зірчасті, що трансформуються в округлі утворення з безладно розташованими бактеріями. В умовах лабораторії диференціювати М.avium і М.intracellulare важко. Перша добре росте при температурі 45 0С, а друга не дає росту протягом 3 тижнів. Від сапрофітних видів їх диференціюють по стійкості до 5,0 % розчину NaCl і нездатності гідролізувати твін-80. Лікування уражень, викликаних комплексом avium-intracellulare, представляє велику проблему, у порівнянні з іншими туберкульозоподібними ураженнями, тому що збудники виявляють множинну хіміорезистентність.
M. xenopi. Молоді культури ростуть у вигляді непігментованих колоній, пізніше з’являється пігмент жовтого кольору. Морфологічно - довгі ниткоподібні палички. Ростуть при 40-45 0С, умовно-патогенні для людини.
M.haemophilum. Виявляє унікальну для мікобактерій здатність до росту на 5,0 % кров’яному агарі (також на середовищі Льовенштайна-Єнсена, доповненому 2,0 % цитратом амонійного заліза). Викликає рідкі випадки гнійних лімфаденітів у дорослих осіб з імунодефіцитами та у дітей без імунодефіциту.
ІУ група – мікобактерії, що швидко ростуть: M.рhlei, M.smegmatis, M.malmoense, M.chelonae (M.abscessus), M. fortuitum ( M.minetti), M.friedmanii і ін. – сапрофітні види, клінічне значення мають лише два останніх види.
Ростуть у вигляді пігментних або безпігментних колоній, частіше в R-формі. Гарний ріст дають протягом 2-5 днів при 25 0С. Найважливіша диференціальна ознака – здатність рости при температурі 45 0С і вище та прискорювати свій ріст при температурному оптимумі.
Непігментовані колонії виростають при посіві малих кількостей матеріалу. Пігментоутворення, як відмінна ознака класифікації Раньона, у даної групи мікобактерій непридатне, тому що на утворення пігменту впливає склад середовища, вік культури, повторні пасажі, є природні пігментоутворюючі варіанти.
M. fortuitum (M.minetti). Ріст у субкультурах на яєчному середовищі з'являється на 2-4 добу у вигляді “розетки”. Морфологічно - короткі палички. На середовищі Льовенштайна-Єнсена можуть поглинати фарбу й забарвлюватися в зелений колір. Потенційно-патогенні для людини.
