6.9.8.Конструирование питательных сред для выращивания микроорганизмов

Многие нетребовательные микроорганизмы (многие псевдомо­нады, широко известная Escherichia coli) хорошо растут на среде очень простого состава

Такая среда называется минимальной (синтетической) (табл. 3.3). Иногда, однако, минимальной среды недостаточно для нормального роста. В этом случае в состав среды вводят некоторые добавки, предварительно установив, в каких из них нуждается дан-

Таблица 6.6.

ный микроорганизм. Для многих почвенных бактерий, например, используют смесь витаминов, состав которой приведен в табл. 6.7.(добавляется в количестве 2-3 мл на 1 000 мл минимальной среды).

При выделении микроорганизмов из природных источников часто появляется необходимость проводить культивирование таким образом, чтобы размножались преимущественно клетки определенного вида микроорганизмов. В таких случаях используется метод накопительных культур, предложенный Виноградским и Байеринком. Для подобных ситуаций часто приходится составлять специальные среды, называемые элективными. Проводя несколько кратковременных пассажей культуры на такой среде, можно получить чистую культуру целевого микроорганизма.

Таблица 6.7.

Построение таких сред требует большого опыта и определенного экспериментального искусства, так что процесс их создания по праву называют конструированием. Аналогичные подходы используют и для культивирования некоторых микроорганизмов, проявляющих специальные требования к составу питательных компонентов среды. В частности, известно много случаев, когда для роста культуры необходимы компоненты, содержащиеся в сложных ростовых добавках: дрожжевом экстракте, кукурузном экстракте, мясном бульоне и т. п. При этом неизвестно, какие именно компоненты такого рода добавок действительно необходимы для клеток данного микроорганизма.

6.9.9.Технология приготовления питательных сред

Питательная среда для культивирования микроорганизмов должна удовлетворять двум основным требованиям. Во-первых, она должна содержать все необходимые для роста компоненты, и, во-вторых, не должна содержать примесей каких-либо микро­организмов, т. е. должна быть стерильной. Обеспечение сте­рильности достигается путем использования подходящей техноло­гии.

Технология стерилизации питательных сред включает в себя достаточно широкий арсенал разнообразных приемов. Главным из них и наиболее традиционным является термическая стерилизация - прогревание среды при высоких температурах, когда большинство микроорганизмов погибает. Для инактивации наиболее распространенных микроорганизмов достаточным оказывается прогрев при 100 °С, иными словами, кипячение среды. Обычно, однако, стараются прогреть среду при более высокой температуре, для чего нагревание проводят при повышенном давлении 3-5 ати (избыточное давление). Температура кипения воды при этом поднимается до 115-130 °С. Для относительно небольших количеств среды такой прогрев осуществляется в специальных герметически закрывающихся аппаратах -автоклавах, в которых стерилизующим агентом является перегретый водяной пар, а сам аппарат представляет собой сосуд с мощным нагревателем, сконструированный так, чтобы выдержать необходимое давление. При термической стерилизации больших объемов сред обработку проводят в ферментационном аппарате так называемым «острым» паром - струей сильно перегретого пара с температурой 130-140 °С; существуют также установки непрерывной стерилизации питательных сред, используемые в производственных условиях, когда объем среды достигает нескольких десятков, а то и сотен кубических метров.

Расчет процесса термической стерилизации основывается на данных о кинетике гибели микроорганизмов под воздействием повышенной температуры. Скорость инактивации микроорганизмов при данной температуре описывается уравнением

где к — зависящая от температуры константа скорости гибели микроорганизмов; N - число жизнеспособных микробных клеток; / - время. Следует отметить, что в это уравнение входит именно число клеток или спор, а не их масса. Из приведенного уравнения видно, что гибель клеток следует кинетике первого порядка, хотя на нее влияет большое количество факторов, так что на практике наблюдаются отклонения от этого закона. Зависимость константы скорости от температуры описывается уравнением Аррениуса

После подстановки и интегрирования при граничных условиях N _е=0 = N₀ получаем

Такой вид после интегрирования уравнение принимает в случае, когда температура в процессе стерилизации меняется по определенному закону. Если она поддерживается постоянной, интегральное выражение существенно упрощается:

Таким образом, зная энергию активации и величину коэффи­циента а, определяемых экспериментально, можно рассчитать: 1) время, необходимое для достижения заданной степени инактивации клеток в стерилизуемой среде; 2) температуру, обеспечивающую заданную степень стерилизации за заданное время; 3) степень стерилизации за данное время при данной температуре.

Если в среде находятся различные виды микробных загрязнений, то приведенная выше зависимость будет представлять обой сумму, слагаемыми которой станут аналогичные величины для каждого вида микроорганизмов, различающиеся по величинам коэффициента а и энергиям активации. С помощью таких же зависимостей можно рассчитать время пребывания стерилизуемой среды в активной зоне при проведении стерилизации непрерывным способом.

Практическое осуществление термической стерилизации пита­тельной среды производится различными способами. Если объем стерилизуемой среды относительно невелик, то ее обрабатывают в автоклаве. Сосуд с подлежащей стерилизации средой закупоривают пробкой, проницаемой для воздуха и непроницаемой для микроорганизмов (обычно это плотный ватно-марлевый тампон), и помещают в автоклав. Затем автоклав нагревают, в нем образуется перегретый пар, который и является стерилизующим агентом. Задавая давление в автоклаве, можно регулировать и температуру обработки, поскольку температура кипения воды зависит от давления. Выдерживая среду в условиях обработки в течение необходимого времени (в зависимости от константы скорости инактивации наиболее устойчивого к термообработке микроорганизма), мы и добиваемся стерильности. Стерилизация в автоклаве попользуется чаще всего в лабораторных условиях. Следует Яри «том отметить, что автоклав относится к опасным для персонала устройствам, так что при работе с ним необходимо строго соблюдать требования техники безопасности.

В случае больших объемов подлежащей стерилизации среды обработку проводят прямо в аппарате, вводя в него перегретый «острый» пар, который нагревает до необходимой температуры весь объем среды. После обработки среду охлаждают, предотвращая при этом попадание в нее микробных загрязнений из внешней среды. Это так называемый периодический процесс.

Следует, однако, отметить, что такой способ проведения стерилизации требует больших затрат энергии и времени, поэтому применяются другие технологические приемы осуществления процесса.

Одним из таковых является непрерывный процесс, сущность которого заключается в следующем. Стерилизуемая среда находится в емкости, из которой ее прокачивают через относительно небольшой по объему аппарат - установку непрерывной стерилизации (УНС). В этой установке представляющей собой эффективный теплообменник -V производится в протоке обработка среды тем же острым паром или

Рис. 6.15. Схема установки непрерывной стерилизации:

/— ввод стерилизуемой среды, 2 — выход стерильной среды

другим теплоносителем. Скорость протока задает время пребывания среды в зоне повышенной температуры, а необходимое время определяется из приведенных выше закономерностей кинетики термоинактивации микроорганизмов. После выхода из зоны повышенной температуры среда поступает в аналогичный теплообменник, в котором она охлаждается до необходимой температуры, и далее поступает в ферментер (рис. 6.15).

другим теплоносителем. Скорость протока задает время пребывания среды в зоне повышенной температуры, а необходимое время определяется из приведенных выше закономерностей кинетики термоинактивации микроорганизмов. После выхода из зоны повышенной температуры среда поступает в аналогичный теплообменник, в котором она охлаждается до необходимой температуры, и далее поступает в ферментер (рис. 6.15).