6.2.Идентификация клонированных днк

Предположим, что рекомбинантные плазмиды удалось вклю­чить в популяцию клеток Е. coli и что содержащие плазмиды клетки удалось обнаружить на агаровых пластинках в селектив­ной среде. В этом разделе мы вкратце рассмотрим методы скрининга полученных таким путем клонов и детального изуче­ния инсерций (вставок) ДНК из интересующих нас клонов.

Прежде всего нам нужно отличать клоны, содержащие плазмиды с инсерциями чужеродной ДНК, от клонов, в состав которых входят только исходные плазмиды; это может быть до­стигнуто с помощью инсерционной инактивации в процессе кло­нирования. Предположим, например, что фрагменты ДНК включены в сайт плазмиды pBR322, расщепляемый рестриктазой Pstl. Поскольку инсерция в этом центре разрывает ген устойчи­вости к ампициллину, то содержащие рекомбинантные плазми­ды клетки будут чувствительны к ампициллину и устойчивы к тетрациклину. Напротив, клетки с плазмидами без инсерции бу­дут устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

В этом случае клоны, содержащие рекомбинантные плазми­ды, можно обнаружить следующим образом. Сначала клетки выращивают на пластинках в присутствии тетрациклина; таким путем избавляются от существенного фона не содержащих плазмиды клеток. Затем применяют метод реплик (отпечат­ков) : войлочную подушечку или нитроцеллюлозную фильтро­вальную бумагу прижимают сначала к исходной матричной пластинке, а затем ко второй пластинке (реплике), получая на ней точную копию распределения колоний на матричной пла­стинке. Если реплика обработана ампициллином, то колонии клеток, содержащих плазмиды с инсерциями в гене устойчиво­сти к ампициллину, растут на матричной пластинке, но не рас­тут после перепечатки.

Поиск в клоне специфических нуклеотидных последователь­ностей может быть осуществлен с помощью ряда методик, ос­нованных на гибридизации денатурированной (т. е. одноцепо-чечной) ДНК из клона с особым нуклеотидным зондом, обычно меченным радиоактивным изотопом ³²Р. Нуклеотидная последо­вательность зонда (которым может быть как ДНК, так имРНК) комплементарна части последовательности искомого сегмента ДНК. Зонды мРНК получают путем выделения мРНК из кле­ток, обогащенных интересующей исследователя генетической информацией, а зонды ДНК выделяют на одной из первых ста­дий клонирования или получают прямым химическим син­тезом.

В методе гибридизации колонии in situ на нитроцеллюлоз-ной фильтровальной бумаге, лежащей на чашке Петри с пита­тельной средой, выращивают реплику клонов. Затем клетки разрушают лизоцимом, а ДНК денатурируют обработкой NaOH, после чего нитроцеллюлозную бумагу отделяют, обрабатывают зондом, промывают и экспонируют с рентгеновской пленкой. На пленке появляются темные пятна в тех местах, где произош­ла гибридизация зонда с комплементарными последовательно­стями ДНК; эти клоны и представляют интерес для дальнейше­го изучения.

Плазмидную ДНК, которую можно выделить ультрацентри­фугированием в градиенте плотности хлорида цезия, далее об­рабатывают рестриктазой. Полученные фрагменты ДНК образу­ют своеобразную картину («отпечатки пальцев») для данной, плазмидной ДНК. Фрагменты могут быть разделены в соответствии с их молекулярными массами методом электрофореза в агарозном геле (0,5—1,5%); для обнаружения фрагментов ДНК часто используют флуоресцентный краситель бромистый эти-дий, специфичный по отношению к двухцепочечным нуклеино­вым кислотам. Путем сравнительного анализа длины фрагмен­тов, образующихся при действии других рестриктаз и при со­вместном расщеплении несколькими рестрикционными эндонук-леазами, получают рестрикционную карту, характеризующую относительные положения различных сайтов рестрикции. По­добные карты чрезвычайно полезны для проверки правильности включения ДНК в заданные участки плазмиды и в качестве основы для дальнейшей работы с рекомбинантными плазми-дами.

Упоминавшиеся выше меченные радиоактивными изотопами зонды можно использовать и для идентификации определенных фрагментов, образующихся при обработке рестриктазами. В ме­тоде блоттинга по Саузерну фрагменты ДНК в геле денатури­руют щелочью и на гель накладывают нитроцеллюлозную плен­ку. Сверху помещают фильтровальную бумагу, в которую пере­ходит буферный раствор; одновременно фрагменты ДНК пере­ходят на нитроцеллюлозную пленку. ДНК ковалентно связыва­ется с нитроцеллюлозой при 80 °С. Затем связанные денатури­рованные фрагменты ДНК обрабатывают, как было описано выше, зондом, экспонируют с рентгеновской пленкой и таким образом идентифицируют полосы на электрофореграмме, соот­ветствующие комплементарным зонду нуклеотидным последо­вательностям.

Современные экспериментальные методы биохимии ДНК на­столько чувствительны, что нескольких нанограммов ДНК, выде­ленных из полосы на гелевой электрофореграмме, достаточно для клонирования или для дальнейшего изучения. Очевидно, что исчерпывающая идентификация фрагмента ДНК должна включать в себя определение его нуклеотидной последователь­ности. В 70-е годы были разработаны два метода быстрого, на­дежного и эффективного определения последовательностей нук-леотидных оснований в ДНК — Максама — Гилберта и Сэнд-жера. Эти методы оказали громадное воздействие на биологи­ческие науки вообще и на биотехнологию в частности.

В методе Максама — Гилберта двойную спираль ДНК сна­чала метят, присоединяя радиоактивную метку к одному концу каждой цепи. Затем ДНК денатурируют и препарат одной из двух цепей разделяют на четыре аликвотные части, каждую из которых обрабатывают специфичным реагентом. В результате каждой из таких обработок селективно разрушается одно осно­вание (или два), а цепи ДНК в этих центрах расщепляются. Для успеха метода существенно, чтобы это разрушение были

РИС.6.2. Определение нуклеотидной последовательности методом Максама- Гилберта. При обработке изучаемой последовательности четыремя специфическими реагентами,разрушающими различные основания,образуется смесь фрагментов, молекулярные массы которых зависят от положения расщепленного основания.Расположение полос на четырех дорожках гелевой электрофореграммы позволяет считывать нклеотидную последовательность непосредственно с геля; считывание сверху вниз соответствует направлению последовательности к меченому концу исходного олигонуклеотида.

частичным; в идеальном варианте желательно, чтобы каждая Цепь расщеплялась бы только в одном центре. Затем образо­вавшиеся в результате таких четырех параллельных расщепле­ний фрагменты изучают на достаточно протяженном полиакрил-амидном геле. Полосы в геле обнаруживают с помощью чув­ствительной к рентгеновскому излучению фотопленки. Опреде­ляемую нуклеотидную последовательность считывают непосред­ственно с четырех параллельных дорожек гелевой электрофоре-граммы (рис. 6.24). Таким методом в одном эксперименте без труда можно выяснить последовательность около 200 нуклеотидных остатков. Метод определения нуклеотидных последова­тельностей по Сэнджеру рассмотрен в работе [21]; обычно его» применяют при изучении более крупных фрагментов ДНК.

Часто возникает необходимость в скрининге из множества различных клонов одного клона (или нескольких клонов), обла­дающих способностью к экспрессии определенного белка. В большинстве случаев для решения такой задачи прибегают к помощи антитела, специфичного по отношению к данному бел­ку. В антитела вводят радиоактивную метку (например, ¹²⁵1> и раствором антител обрабатывают изучаемые колонии на пла­стинке; затем их промывают и с помощью рентгеновской плен­ки обнаруживают искомые колонии, содержащие данный белок. В другом варианте антитела связывают с ферментом и антиге­ны обнаруживают по свойствам этого фермента. Идентифициро­вать колонии, содержащие искомый белок, можно, например, с помощью хромогенного субстрата (т. е. субстрата, изменяю­щего свою окраску или окрашивающегося после обработки? ферментом). Более чувствительные иммунохимические методы, с помощью которых можно обнаружить белки в концентрациях 1—5 молекул в клетке Е. coli, описаны в приведенной в конце главы литературе.

Объем и тематика этой книги не позволяют обсудить де­тально все методы идентификации и изучения клонов; все же надо надеяться, что даже приведенные здесь данные дают представление о том, насколько трудоемкой, длительной и уто­мительной может быть работа по скринингу клонов и по конт­ролю каждого шага в построении новых рекомбинантных мо­лекул. Хотя для специалиста в области биохимической техно­логии больший интерес представит тема следующего раздела,, посвященного экспрессии клонированных генов, следует отда­вать себе отчет в том, что основным препятствием в программе синтеза чужеродного белка в Е. coli или другой клетке-хозяине скорее всего будет именно клонирование гена. В то же время успехи методических разработок и развитие их автоматизации, будут содействовать внедрению «типовых методик» молекуляр­ной генетики, что в свою очередь создаст основы для существен­ного расширения набора доступных и интересных генов и регу-ляторных последовательностей.