6.5.Получение инсулина на основе методов генетической инженерии

Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень саха­ра в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, кото­рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно­сосудистых заболеваний и рака. Инсулин — небольшой глобуляр­ный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоя­щий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепо-чечного предшественника — препроинсулина, содержащего кон­цевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С пептид). При удалении сигналь­ного пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислот­ных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пеп-тидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при за­мыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщеп­ления С-пептида образуется инсулин.

Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжелая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсу-линзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибе­лью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лан-герганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удается справляться с помощью соответствующих диет и режи­ма. Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и постав­ляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприя­тия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г крис­таллического инсулина необходимо 800 — 1000 кг исходного сырья.

Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг. тремя коллективами исследователей в США, Китае и ФРГ. В 1980 г. дат­ская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го ос­татка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не раз­личались по активности и времени действия.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клет­ках Е. coli (рис. 6.7). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к З'-концу гена фермента р-галактозидазы и вводил­ся в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. coli, трансформиро­ванные такими рекомбинантными плазмидами, производили гиб­ридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента р-галактози-дазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом.

В 1981 г. синтезирован ген-аналог проинсулина — мини-С-про-инсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сег­мент из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в Е. coli.

В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли р-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обрат­ной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНК встрои­ли в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре про­инсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллина­зы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином.

В 1978 г. сотрудниками Института биоорганической химии под руководством акад. Ю. А. Овчинникова был осуществлен синтез двух структурных генов, кодирующих синтез нейропептидов: лейцин-энкефалина и брадикшшна. Синтезированный ген лейцин-энкефа-лина имел два «липких» конца:

Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагмен­том природной ДНК, содержащим промотор и проксимальную часть гена белка р-галактозидазы кишечной палочки Е. coli, в плазмиду-

Рис.6.7. Схема синтеза инсулина.

вектор pBR322 и обработан смесью рестриктаз — EcoRI и BamHI. Полученная рекомбинантная плазмида рЕк была трансформиро­вана в клетки Е. coli. В результате экспрессии встроенного гена бактерия начала продуцировать гибридный (химерный) белок, со­держащий на N-конце участок р-галактозидазы, а на С-конце — последовательность нейропептида. С помощью бромциана химер­ный белок расщепляли in vitro и получали активный лейцин-энке-фалин. На рис. 6.8 представлены схема клонирования синтетичес­кого гена лейцин-энкефалина и его экспрессия в клетках кишеч­ной палочки.

Аналогичным путем был синтезирован соматостатин — гор­мон гипоталамуса (рис. 6.9). Молекула соматостатина состоит из 14 аминокислотных остатков. Соматостатин подавляет выделение инсу­лина и гормона роста человека. В Национальном медицинском цен­тре «Хоуп» (Калифорния) был осуществлен химико-ферментатив­ный синтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин. Участок ДНК, кодирующий гормон соматостатин, получен путем соединения тринуклеотидов. Из 52 н. п. синтетического гена 42 пары составляли структурный ген гормона, а остальные слу­жили для присоединения синтетического гена к плазмиде pBR322,

Рис.6.8. Схема синтеза гибридного и активного лейцин-энкефалина

Рис.6.9. Первичная структура молекулы соматостатина.

а также к сегменту лактозного оперона (lac) из генома Е. coli или к р-галактозидазному гену. Такую синтетическую чужеродную ДНК встраивали непосредственно за бактериальным геномом (или внут­ри его) после расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеаза-ми с образованием в результате трансляции гибридного белка.

Основные этапы генно-инженерного синтеза соматостатина по­казаны на рис. 6.10. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 Е. coli вблизи конца гена, кодирующего фер­мент р-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в бакте­риальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибрид-

Рис.6.10. Схема синтеза соматостатина в бактериальной системе

ный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от р-галак­тозидазы BrCN. Такой сложный способ получения гормона был необходим, так как соматостатин, синтезированный в виде свобод­ных молекул, быстро деградирует под действием бактериальных протеаз. Первый синтез соматостатина генно-инженерным спосо­бом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10 ООО молекул на одну клетку. Из 100 г биомассы Е. coli, выра­щенной в ферментере объемом 8 л, удалось выделить 5 мг сомато­статина, т.е. столько, сколько можно его выделить из 100 г овечь­их мозгов.