6.8.1.8.Генно-инженерные подходы к решению проблемы усвоения азота

Азот — один из самых необходимых элементов для растений. Его недостаток в почве или питательном субстрате часто приводит ра­стение к гибели, поэтому в первую очередь необходимо внесение в почву азотных удобрений. Однако их производство требует очень больших энергетических затрат, поэтому оно дорогостояще. Сто­имость азотных удобрений в 6 раз выше стоимости фосфорных удоб­рений и в 16 раз выше стоимости калийных удобрений. При этом растения используют только от 30 до 70 % внесенных в почву до­ступных форм азота, остальное просто вымывается из почвы, за­грязняя окружающую среду. Гораздо более естественно и доступно снабжение растений азотом путем его биологической фиксации.

Фиксация атмосферного азота (диазотрофность) — свойство прокариотических организмов. Азотфиксирующие организмы де­лятся на симбиотические (90 %) и свободноживущие (10 %). Фик­сация атмосферного азота связана преимущественно с симбиоти-ческими микроорганизмами. В настоящее время известны четыре основные системы симбиоза, имеющие большое значение не толь­ко для естественных сообществ, но и для сельского хозяйства, лесоводства. Это Rhizobia — бобовые растения, Azolla-Anabaena — рис, Actinomyces — деревья, Spirillum — травы. Атмосферный азот фиксируется благодаря уникальному ферменту — нитрогеназе.

В 1960 г. американские исследователи показали, что нитрогена-за сохраняет свою активность в бесклеточных экстрактах Clostridium pasteurianum. Это послужило толчком для начала активных иссле­дований биохимии азотфиксации, структуры и механизма дей­ствия нитрогеназы. К 1981 г. нитрогеназа была выделена из 36 ви­дов микроорганизмов. Она считается одним из наиболее сложных ферментов, использующих простые субстраты. Кроме азота нит­рогеназа может восстанавливать ацетилен, цианистый водород, закись азота и некоторые другие соединения. Восстановление аце­тилена в этилен позволило разработать надежный тест для обна­ружения азотфиксирующей активности. Непременное условие ра­боты нитрогеназы — ее защита от кислорода, который ингибиру-ет не только активность нитрогеназы, но и ее биосинтез.

Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изуче­нию генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumonia

и Е. coli. С помощью техники рекомбинантных ДНК были состав­лены генетические карты генов азотфиксации (л»/-генов), кото­рые показали сходную организацию генов у большей части азот-фиксирующих организмов. Было установлено, что л//-гены распо­ложены между генами, кодирующими биосинтез гистидина (his) и генами, ответственными за усвоение шикимовой кислоты (shiA). Гены, кодирующие синтез белковых субъединиц компонентов нит-рогеназы, образуют единый оперон (рис. 6.14). В клетках симбиоти-ческих бактерий Rhizobium leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii плаз-миды, кроме структурных генов нитрогеназы, содержат гены, отве­чающие за развитие корневых клубеньков у определенных видов бобовых.

Конструирование плазмид, несущих т/-гены, позволяет переда­вать способность к фиксации азота организмам, не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме Е. coli, такой перенос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приводить к не­желательным эффектам. Так, перенос генов в штамм Erwinia (бак­терии, вызывающие гниение растений) может усилить его пато­генное действие. Кроме того, существует вероятность случайного переноса вместе с л//-генами каких-то нежелательных генов.

В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы вве­дения генов азотфиксации в клетки растений; создания ризоцено-зов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфик-сирующими организмами; повышения мощности корневой систе­мы бобовых растений для увеличения на ней количества клубень­ков. Кроме того, предполагается создание новых азотфиксирующих систем путем введения азотфиксирующих микроорганизмов в кал-лусные ткани растений с последущим образованием из них расте-ний-регенерантов, а также повышение эффективности фиксации азота путем воздействия на гены, контролирующие этот процесс.

Наиболее интересна первая проблема — введение ш/-генов в клетки растений. Однако ее решение сопряжено с рядом трудно­стей. Основная — разрушение нитрогеназы под воздействием кис­лорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд при­способлений, защищающих бактерии от свободного кислорода.

Среди них присутствие в клетках клубеньков легоглобина — гем-содержащего белка, который встраивается в мембрану бактероида (увеличенная в размере бактериальная клетка, характеризующая­ся наибольшей способностью к фиксации азота) и регулирует по­ступление кислорода. Легоглобин кодируется в геноме раститель­ной клетки-хозяина, но его синтез начинается только после про­никновения бактерий в эту клетку. У цианобактерий механизм за­щиты нитрогеназы от кислорода иной. Азотфиксация идет в гете-роцистах, а фотосинтез — в обычных клетках. Поэтому кислород, выделяющийся в процессе фотосинтеза, не ингибирует фиксацию азота. Таким образом, введение только л//-генов в какую-то расти­тельную клетку не решает проблемы. Если нитрогеназа будет син­тезироваться в этой клетке, в частности в клетках злаков, то она разрушится под действием кислорода, присутствующего в клетке. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфикса­ции, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию боль­шого количества энергии, которое требуется для фиксации азота.

Таким образом, более перспективно повышение эффективно­сти фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а так­же увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов кле­точной инженерии.