6.3.Экспрессия эукариотических белков в е. Coli

Первыми примерами успешного применения генетической¹ инженерии в биотехнологии были синтезы ряда ценных белков-эукариот в клетках Е. coli. В этом разделе мы прежде всего-рассмотрим методы получения генов, пригодных для экспрессии¹ эукариотических белков, затем обсудим требования, предъявиляемые к вектору экспрессии, и завершим раздел рядом заме­чаний, касающихся проблем скрининга продуктов экспрессии генов, а также устойчивости генов и соответствующих белков.

Нетрудно понять, что прямая экспрессия генов эукариот Е. coll связана с одним принципиальным препятствием. Прока­риоты вообще и Е. coll в частности не обладают биохимиче­ским механизмом, способным осуществлять сплайсинг РНК. Поэтому эукариотический ген, включенный непосредственно в Е. coll (при условии рассматриваемой ниже соответствующей бактериальной регуляции экспрессии), не будет нормально экс-прессироваться. В Е. coll будут транслироваться последова­тельности интронов эукариотического гена мРНК и синтезиру­ющийся полипептид в общем случае будет резко отличаться от нормального эукариотического белка.

Очевидно, нам нужно каким-то образом приготовить бакте­риальный ген, отвечающий эукариотическому белку, т. е. такой ген, который содержал бы только нуклеотидную последова­тельность, кодирующую первичную структуру белка, и не имел бы ни одного интрона. Эта цель может быть достигнута двумя принципиально различными путями. Один из них сводится к хи­мическому синтезу заданной нуклеотидной последовательно­сти. Хотя здесь мы не можем углубляться в детали химическо­го синтеза генов (интересующийся этой проблемой читатель мо­жет найти все необходимые сведения в литературе), все же необходимо подчеркнуть, что синтетическая химия ДНК пока еще не позволяет осуществлять прямой синтез всего гена. Обычно синтезируют олигонуклеотиды с частично перекрыва­ющимися последовательностями, которые обладают способно­стью к самосборке в полную двухцепочечную нуклеотидную по­следовательность за счет образования водородных связей в па­рах оснований. В качестве примера на рис. 6.3 приведен ген, кодирующий последовательность 21 аминокислотного остатка цепи А инсулина человека; этот ген был собран из 12 различ­ных олигодезоксирибонуклеотидов, построенных из 10—15 нук-леотидных остатков. При планировании синтеза гена следует принимать во внимание и ряд других требований, связанных с клонированием и экспрессией, в том числе свойства кодонов, отсутствие сигналов терминации, наличие сайтов рестрикции.

Возможность химического синтеза генов или их фрагментов создает базу для чрезвычайно перспективной области белковой инженерии. В принципе уже сейчас мы можем заменить любую аминокислоту в белке, с тем чтобы попытаться повысить биоло­гическую активность или технологическую устойчивость данно­го белка. Более того, мы можем заставить клетку синтезировать новые (или, во всяком случае, неизвестные нам) аминокислотные последовательности и таким путем создавать новые ката­лизаторы, лекарственные препараты и компоненты пищевых продуктов. К сожалению, в настоящее время мы знаем так ма­ло о связи между первичной структурой и функцией белков, что возможности улучшения свойств белков путем их модификации пока что остаются практически нереализованными.

В другом пути получения бактериального гена, соответству­ющего эукариотическому белку, исходят из зрелой эукариоти-ческой матричной РНК, уже прошедшей стадию сплайсинга.

РИС. 6.3. Ген, отвечающий цепи А инсулина человека (аминокислотная по­следовательность приведена в верхней части рисунка). Этот ген был синте­зирован из 12 олигодезоксирибонуклеотидов Ai—А₁₂. [Воспроизведено из статьи; Crea R., Kraszewski A., Hirose Т., Itakura К., Chemical Synthesis of Genes for Human Insulin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75, 5765 (1978).]

Как схематично показано на рис. 6.4, соответствующая необхо­димому белку мРНК сама может выполнять роль матрицы, на которой особый фермент, обратная транскриптаза, может синте­зировать комплементарную цепь ДНК. Цепи мРНК и ДНК за­тем разделяют, на цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы строят комплементарную цепь, после чего специфическим фер­ментом нуклеазой S1 отщепляют небольшой петлевой одноце-почечный участок. В результате образуется молекула двухцепо-чечной комплементарной ДНК (кДНК). К последней, как пока­зано на рис. 6.4, с помощью концевой трансферазы присоединя­ют гомополимерные последовательности дезоксицитидина (dC). Таким путем создаются предпосылки для последующего клони­рования, предпочтительно с плазмидным вектором pBR322, рас­щепленным рестриктазой Pstl и имеющим гомополимерные по­следовательности (dG).

Для эффективной экспрессии структурному гену должны предшествовать нуклеотидные последовательности, обеспечива­ющие инициацию транскрипции (промотирующая последова­тельность) и начало трансляции (связывающий рибосому сайт и стартовый кодон); за структурным геном должен следовать терминирующий кодон, означающий прекращение трансляции, и ^терминатор транскрипции (вспомните рис. 6.6). В векторы экс­прессии входят все эти регуляторные последовательности, уча­сток начала репликации, а также по меньшей мере один мар-1кер селекции. С помощью клонирования и синтетическими ме-^тодами получено большое число регулирующих экспрессию по-

РИС.6.4. Схема синтеза двухцепочечной ДНК с нуклеотидной последовательностью,комплементароной нуклеотидной последовательности молекулы мРНК (волнистая линия). В результате синтеза получают пригодную для клонирования молекулу комплементарной ДНК (кДНК)

ледовательностей, пригодных для включения в векторы экс­прессии. Чаще других используются промоторы lac, trp и Xpz..

Как правило, желательно, чтобы применяющийся промотор был регулируемым, т. е. включался только при каком-либо из­менении параметров среды, например при добавлении индукто­ра, инактивации репрессора или при изменении температуры. В хорошо отработанной системе экспрессии содержание белка, отвечающего клонированному гену, может достигать 70% от всех клеточных белков, хотя обычно эта величина составляет от 10 до 25%. Поскольку продукт экспрессии не выполняет ни­какой полезной для клетки-хозяина функции, столь серьезное отвлечение биосинтезирующего аппарата клетки на синтез не-

РИС.6.5. а- электронная сканирующая микротография рекомбинантных

нужных клетке белков может сказаться на скорости роста кле­ток и даже на их жизнеспособности. Поэтому в практической работе, как правило, условия культивирования в реакторе ме­няют таким образом, чтобы сначала экспрессия клонированного гена была практически подавлена и обеспечивался в основном быстрый рост клеточной массы вплоть до достижения необхо­димой плотности клеток, а затем с максимальной скоростью осуществлялась бы экспрессия.

Когда в Е. coli концентрация чужеродных белков достигает высокого уровня, они аккумулируются в клетке в виде плотных образований (рис. 6.5). Последние представляют собой глав­ным образом чужеродный белок, но содержат и небольшие ко­личества бактериальных белков, причем чужеродный белок обычно находится в денатурированном состоянии и клетки, со­держащие плотные образования, часто имеют искаженную фор­му. Поэтому, хотя высокая концентрация белка в той или иной степени облегчает процессы выделения, его дальнейшая стаби­лизация и превращение в активную форму обусловливают не­обходимость дополнительных технологических стадий.

Конечная продуктивность рекомбинантной культуры может лимитироваться обусловленной тем или иным фактором неста­бильностью белка. Бактерия Е. coli содержит внутриклеточные протеазы, способные каким-то образом узнавать небольшие аномальные белки и разрушать их. В обычных клетках эти про­теазы выполняют полезную функцию, разрушая ошибочно син­тезированные белки до аминокислот, которые затем могут вновь использоваться для синтеза белков; в рекомбинантных систе­мах подобные протеазы могут быстро расщепить весь чужерод­ный для клетки белок. Для повышения устойчивости последне­го часто методами генной инженерии синтезируют гибридный белок, состоящий из белка Е. coli, к которому (как правило, к С-концу) присоединен чужеродный белок. Такой подход при­менялся для стабилизации ряда относительно небольших поли­пептидов, в том числе соматостатина (14 аминокислот), цепей А (21 аминокислота) и В (30 аминокислот) инсулина человека. В этих случаях роль соединительного звена между белковым фрагментом Е. coli и пептидом человека выполнял остаток ме-тионина; при последующей обработке бромцианом, расщепля­ющим полипептидные цепи по остаткам метионина, образовы­вался активный пептид человека. (К счастью, ни один из пере­численных полипептидов не содержал остатков метионина!)

На рекомбинантных популяциях могут сказываться две раз­личные формы генетической нестабильности. Во-первых, опре­деленная часть вновь образующихся клеток может не содер­жать плазмид. В этом случае благодаря так называемой сегре­гационной неустойчивости не несущие плазмид клетки могут подавлять рост содержащих плазмиды продуктивных клеток, если только система не находится под давлением отбора. Одна­ко даже под давлением отбора сегрегационная нестабильность снижает общую скорость роста и продуктивность рекомбинант­ной популяции. Другой тип нестабильности — структурная не­устойчивость — приводит к неспособности клеток синтезировать активный белок. Причина этой нестабильности может заклю­чаться в мутации структурного гена или регуляторных нуклео-

тидных последовательностей. К сожалению, эта форма неста­бильности не поддается регуляции путем давления отбора.