6. Технология рекомбинантных днк

6.1.Векторы для Escherichia coli

Векторами называют молекулы ДНК, обеспечивающие ам­плификацию фрагмента ДНК в растущей популяции клеток. Чтобы вектор отвечал всем предъявляемым к нему в процессе клонирования требованиям, он должен обладать следующими свойствами:

1. Способностью реплицироваться в клетке-хозяине.

2. Способностью включать чужеродные ДНК различной моле­кулярной массы без нарушения способности к репликации.

3. Легкостью введения в клетку-хозяина после включения чуже­родной ДНК.

4. Наличием генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю положительную селекцию клеток, содержащих век­тор.

5. Наличием только одного сайта, подвергающегося расщепле­нию одной или несколькими рестрикционными эндонуклеа-зами.

Для клонирования ДНК в Е. coli применяли два класса векто­ров— плазмиды и бактериофаги. Здесь основное внимание бу­дет уделено плазмидным векторам.

Как мы уже упоминали выше, при введении плазмид в клет­ки Е. coli используется механизм трансформации. Поскольку трансформированная клетка Е. coli может включить только од­ну плазмиду, а для последующего выделения, идентификации и применения интересующих нас последовательностей ДНК необ­ходим клон, состоящий из большого числа идентичных клеток, содержащих плазмиды, то плазмида обязательно должна обла­дать способностью к репликации в растущей бактериальной клетке. Для этого в свою очередь нужно, чтобы в состав плаз­миды входил участок начала репликации — нуклеотидная по­следовательность (около 600 пар оснований в случае плазмид Е. coli типа Со1Е-1), направляющая и регулирующая процесс репликации таким образом, чтобы каждая клетка содержала достаточное число копий плазмид (обычно около 30).

Немаловажны и генетические маркеры селекции. Если, на­пример, в плазмиду включить ген устойчивости к антибиотику, то быстрая положительная селекция содержащих плазмиды клеток не вызовет затруднений. Для этого достаточно вырастить клетки на среде, содержащей антибиотик в такой концентрации, которая приведет к гибели всех не имеющих плазмиды клеток, но в то же время обеспечит рост клеток, содержащих плазми­ды, а следовательно, и ген устойчивости к антибиотику. Другой общий подход к селекции заключается в использовании мутант-ной клетки-хозяина, у которой отсутствует фермент, необходи­мый для роста в определенной среде, и в одновременном введе­нии соответствующего этому ферменту нормального гена в ре-

Рис.6.1. Генетическая арта плазмиды рBR322. Показаны локусы генов и ряд сайтов рестрикции. Расшифровона последовательность всех 4363 пар оснований плазмиды.

комбинантную плазмиду. В этом случае экспрессия гена плаз­миды комплементирует генетический дефект клетки-хозяина.

В технологии рекомбинантных ДНК. маркеры селекции в плазмидах могут выполнять две различные функции. Во-первых, методы положительной селекции, позволяющие быстро иденти­фицировать содержащие вектор колонии, резко интенсифициру­ют лабораторные исследования. Во-вторых, при последующем выращивании содержащих плазмиду клеток давление отбора (обусловленное, например, введением в питательную среду ан­тибиотика) сводит к минимуму конкуренцию со стороны любых не содержащих плазмиду клеток, которые могут возникать в хо­де роста популяции.

Плазмидные векторы для клонирования в Е. coli особенно широко изучались в последние годы. К числу наиболее попу­лярных относится плазмида pBR322 (рис. 6.1), содержащая ряд единичных сайтов рестрикции, гены устойчивости к тетра­циклину и ампициллину, а также участок начала репликации, обеспечивающий амплификацию плазмиды в клетке. Здесь под амплификацией (экстракопированием) понимается существенное повышение количества плазмид по отношению к хромосом­ной ДНК. В случае pBR322 и родственных плазмид амплифи­кация становится возможной благодаря тому обстоятельству, что в отличие от хромосомы репликация плазмиды в клетке-хо­зяине может осуществляться и тогда, когда белковый синтез остановлен. Поэтому добавление к культуральной жидкости ин­гибитора белкового синтеза, например хлорамфеникола, приво­дит к синтезу от 30 до 1000 и более копий плазмиды, а следо­вательно, и клонируемой ДНК. Это позволяет получить послед­нюю в количествах, достаточных для ее идентификации и после­дующего использования в качестве реагента при конструирова­нии других ДНК. В плазмиде pBR322 и родственных векторах могут клонироваться сегменты чужеродных ДНК, содержащие до 15 тысяч пар оснований.

В качестве клонирующего вектора широко изучался также бактериофаг К, который сохраняет способность к репликации и литичеокие функции после делении 25% генома дикого типа; это позволяет клонировать сегменты чужеродной ДНК, содер­жащие до 12 тысяч пар оснований. Значительно большие сег­менты ДНК (до 50 тысяч пар оснований) удается клонировать с помощью гибридных плазмидно-фаговых К векторов, называе­мых космидами; последние могут быть введены в головку и хвост фага Я. По этой причине векторы-бактериофаги предпоч­тительнее в тех случаях, когда возникает необходимость в кло­нировании библиотек, состоящих из целого генома эукариоты или из ее очень больших фрагментов. Полезные векторы полу­чали также из фагов с одноцепочечным геномом, например из фага М13. Получаемые с их помощью одноцепочечные клоны особенно удобны для определения нуклеотидных последователь­ностей ДНК по методу Сэнджера. Следующий раздел будет по­священ методам выяснения последовательностей нуклеотидных остатков и другим методам идентификации клонированных ДНК.