Работа 1. Подсчёт количества лейкоцитов

Для подсчета количества лейкоцитов кровь следует развести жидкостью, которая устранила бы эритроциты. Разбавляющими жидкостями для подсчета являются гипотонические растворы, гемолизирующие эритроциты. Дистиллированная вода гемолизирует эритроциты. Добавляемая уксусная кислота просветляет протоплазму лейкоцитов, вследствие чего ядра хорошо видны. Добавление краски (генцианвиолета), окрашивающей ядра способствуют различию их формы.

Состав жидкости Тюрка для разбавления:

Ледяная уксусная кислота - 3см³, 1% водный раствор генцианвиолета - 3 см³, дистиллированная вода - 300см³.

Разбавление крови с помощью смесителя

Для разбавления лейкоцитов применяется смеситель, разбавляющий не в 200 раз, а только в 20, поэтому в смесителях для лейкоцитов имеются метки: на капилляре цифры 0.5 и 1, выше расширения цифра 11 (рис. 12).

. Набрать в смеситель кровь до метки 0.5 и жидкость Тюрка до метки 11. Перевести смеситель в горизонтальное положение, снять резиновую трубочку, задать оба конца пальцами и встряхивать 1.5 минуты.

Разбавление крови пробирочным методом

Разводят исследуемую кровь в 20 раз, для этого в сухую пробирку наливают 0,4 мл уксусной кислоты. Набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, следя за тем, чтобы из пипетки кровь не вылилась.

Рис. 12.Смесители.

В - смеситель для эритроцитов, Г - смеситель для лейкоцитов.

Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки, тщательно перемешивают (повторно набирая и выдувая смесь крови с уксусной кислотой). Маркируют пробирку и оставляют до мо­мента счета (допускается счет лейкоцитов не более чем через 2…4 ч после взятия крови).

Счисление лейкоцитов

Заправить счетную камеру разбавленной жидкостью, как в предыдущем случае, при подсчете эритроцитов. Сосчитать лейкоциты на площади 100 больших квадратов, сумму умножить на 50, что будет соответствовать количеству лейкоцитов в 1 мм³ крови.

По международной системе измерения общую сумму лейкоцитов умножить на 10⁶, что будет соответствовать количеству лейкоцитов в одном литре крови. Пример: в 100 больших квадратах подсчитали 140 лейкоцитов, в 1 мм³ крови их будет 7000 (140 * 50), а в одном литре крови 7 * 10⁹ (СИ).

У здоровых лошадей, крупного и мелкого рогатого скота в крови содержится 6…10 Г/л лейкоцитов (Г = 10⁹; читают: гига на литр); у свиней лейкоцитов больше – 8…16, а у птиц – 20…40 Г/л.

Работа 2. Определение групп крови

Эритроциты крови одного животного могут склеиваться сывороткой другого. Происходит это при наличии в эритроцитах веществ которые склеиваются (агглютиногенов) и склеивающих веществ сыворотки (агглютининов).

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ - склеивания сывороткой крови одного индивидуума эритроцитов другого, наступает при смешивании одноименных агглютининов и агглютиногенов, что может возникнуть при переливании несовместимой крови. Различают два вида агглютиногенов – А и В, и два вида агглютининов - ,.

Взять чистое предметное отекло, поместить его на белую бумагу. Во избежание ошибки сделать на стекле пометки для сывороток группы I(O), II(А), III(В) и IV (АВ), а затем ниже подписи нанести разными пипетками по 1…2 капли сыворотки всех трех групп.

Для прокалывания пальца человека используют скарификатор. Затем перенести кровь отдельными чистыми палочками в каждую каплю стандартной сыворотки. Можно переносить кровь углом чистого предметного стекла, причем каждой капли сыворотки можно касаться только одним углом. Количество исследуемой крови должно быть значительно меньше количества сыворотки.

Каждую каплю крови тщательно размешать с сывороткой, пока смесь не будет иметь равномерную розовую окраску. За реакцией агглютинации наблюдают в течение 5 минут, периодически покачивая предметное стекло.

Если капля смеси остается гомогенной, равномерно окрашенной, то значит, что агглютинации нет. При агглютинации капля состоит из комочков красного цвета, разделенных прозрачной смесью плазмы и стандартной сыворотки. Для исключения «холодовой агглютинации» к капле сыворотки с кровью приливают каплю физиологического раствора комнатной температуры.

Для определения групп крови отметить, в каких каплях стандартной сыворотки произошла или нет агглютинация. Сыворотки группы I(O) и IV(АВ) являются контролем.

Если агглютинация не произошла в сыворотках ни одной из групп, то исследуемая кровь будет I группы.

Если агглютинация произошла в сыворотках I() иIII() групп, то исследуемая кровь -II группы.

Если агглютинация произошла в сыворотках I() иII() групп, то исследуемая кровь –III группы.

Если агглютинация произошла в сыворотках I(),II() иIII() групп, то исследуемая кровь -IV группы. В сыворотке IV (0), группы агглютинации не происходит, так как там не содержатся агглютинины.

Около 45 % населения имеют 1 группу, 35 % - 2 группу, 15 % - 3 группу, 6 % - 4 группу. В эритроцитах 85 % людей содержится антиген – резус – фактор. Занесите таблицу (табл. 15) в тетрадь.

Таблица 15 Схема определения групп крови.

Агглютиногены в эритроцитах групп крови	Агглютинины в плазме (сыворотке)
	I()	II()	III()	IV(0)
I (0)	-	-	-	-
II (А)	+	-	+	-
III (В)	+	+	-	-
IV (АВ)	+	+	+	-

Работа 3. Определение рН-фактора (по стандартно-универсальному реагенту анти-резус в пробирке без подогрева)

На дно химической сухой пробирки вносят одну каплю стандартного реагента анти-резус и одну каплю исследуемой крови.

Содержимое пробирки необходимо перемещать, слегка встряхивая, и медленно наклонять почти горизонтально, чтобы капля как можно больше растеклась по пробирке, при этом реакция будет белее выраженной. Поворачивать пробирку нужно не менее трёх минут, за тем в пробирку добавить 5 мл физиологического раствора и перемешать не взбалтывая. Провести оценку результатов. Наличие крупных хлопьев на фоне просветлённой жидкости указывает на рН (+). Если в пробирке гомогенное окрашивание жидкости и при встряхивании образуются перламутровые волны, то это рН(-).

ВОПРОСЫ;

1. Назовите функции лейкоцитов.

2. Расскажите методику подсчета лейкоцитов.

3. Дайте характеристика групп крови у человека.

4. Какие существуют группы крови у животных?

5. Как определить группу крови у человека?

ЗАНЯТИЕ 8. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ОКРАСКА МАЗКОВ КРОВИ

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Освоить методику приготовления мазков крови, приготовить и окрасить мазок крови.

Работа 1. Приготовление и окраска мазков крови

Для получения правильных мазков (тонких, равномерных, достаточно длинных) крови необходимо иметь чистые, хорошо обезжиренные предметные стекла. Обезжиривают стекла смесью спирта и эфира. Предметное стекло зажать между большим и средним пальцами левой руки. На стекло (со стороны среднего пальца) нанести каплю крови.

В правую руку взять шлифованное стекло, краем коснуться капли крови (угол наклона 45…50°) и дать возможность распределиться крови между двумя стеклами. Затем легким скользящим движением растянуть каплю по поверхности предметного стекла.

Полученный, таким образом, мазок высушить на воздухе и написать на нем кличку или номер животного.

Существует много методов окраски мазков, мы воспользуемся окраской по Романовскому в модификации Филлипсона.

Реактивы: 1 часть готовой краски Романовского и 3 части этилового спирта. Компоненты тщательно смешивают. Краска сразу же готова к употреблению Дистиллированная вода нейтральной реакции. Приготовленный краситель наливают на нефиксированный мазок, покрывая его полностью, и через 1…2 минуты, не сливая красителя, прибавляют к нему по каплям дистиллированную воду. Например: 5 капель краски + 4 капли воды. Следят за тем, чтобы вода при соединении с краской не сливалась с мазка. Через 15 минут краситель смывают водой и мазок высушивают.

Хорошим мазком считается такой, в котором кровь располагается на стекле в виде равномерной, не выходящей за край стекла, тонкой полоски.

ВОПРОСЫ:

1. Как приготовить мазок крови?

2. Как осуществляется фиксация мазков и их окраска?

ЗАНЯТИЕ 9. ВЫВЕДЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ ФОРМУЛЫ

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с формами гранулоцитов и агранулоцитов в крови сельскохозяйственных животных, вывести лейкоцитарную формулу у здорового животного.