МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

Дніпропетровський державний аграрний університет

Кафедра епізоотології

та інфекційних хвороб

факультет ветеринарної

медицини

Методичні рекомендації щодо проведення лабораторно-практичних занять зі спеціальної мікробіології

Дніпропетровськ, 2010

Методичні рекомендації до розділу спеціальної ветеринарної мікробіології дисципліни „Ветеринарна мікробіологія”. Дніпропетровський державний аграрний університет Дніпропетровськ, 2010. – 58 с.

Методичні рекомендації складені відповідно до програми із спеціальної мікробіології. Кількість, перелік та порядок виконання робіт на лабораторних заняттях визначені робочим планом вивчення курсу мікробіології. Кожна робота розпочинається коротким теоретичним обґрунтуванням матеріалу для вивчення що полегшує самостійну підготовку студентів до виконання лабораторних завдань.

Методичні рекомендації розраховані для проведення лабораторних занять, призначених для студентів 2 курсу з повним та скороченим терміном навчання факультету ветеринарної медицини.

Укладачі: Ткаченко О.А. – д.в.н., професор

Усеєва Н.Г. – ст. викладач

Білан М.В. – к.в.н., доцент

Рецензенти: професор кафедри паразитології та інвазійних хвороб М.П. Високос.

Методичні вказівки розглянуто і ухвалено до друку кафедрою епізоотології та інфекційних хвороб 22.12.2004 року, протокол № 7 та науково-методичною радою факультету ветеринарної медицини ДДАУ 25.12.2004 р., протокол № 4.

Тема 1. Лабораторна діагностика стафілококозів

Стафілококози – бактеріальні інфекції, які викликаються патогенними стафілококами, супроводжуються характерним утворенням у різних місцях тіла тварин гнійників, розвитком гноєрідних процесів у вигляді абсцесів, флегмон, маститів, ендометритів, пневмоній, артритів, сепсису. Токсигенні штами стафілококів можуть викликати харчові отруєння у людей. До хвороби схильні коні, велика рогата худоба, вівці, кози, свині, рідко птиця.

Названі бактерії відносять до роду Staphylococcus. По сучасній класифікації (1984) їх більше 20 видів. Практичний інтерес мають патогенні (гемолітичні) коки в основному вид S. aureus, рідко S.epidermidis.

Патологічним матеріалом при стафілококозах є гнійний ексудат з ран, при маститах – проби молока з ураженого вим’я, гній з абсцесів, при ендометритах виділення з матки. Матеріал відбирають стерильними ватними тампонами або стерильними шприцами і поміщають у стерильні пробірки, закривають пробками, доставляють у лабораторію.

Бактеріологічне дослідження включає: виявлення збудника у матеріалі методом світлової мікроскопії, виділення чистої культури посівом на живильні середовища і ідентифікацію збудника за морфологічними, культуральними, ферментативним та токсигенними ознакам (методом біопроби).

Мікроскопія: на предметне скло наносять краплю фізіологічного розчину і вносять (розтирають) бактеріологічною петлею краплю гною. Мазки висушують, фіксують, фарбують за Грамом. Стафілококи мають кулясту форму діаметром 0,8-1,0 мкм (сапрофіти крупніші – 2-4 мкм), розміщуються різними за величиною скупченнями типу виноградного грона. В мазках із патологічного матеріалу зустрічаються моно- і диплококи, грампозитивні, не рухливі, не утворюють спор та капсул.

Культивування та культуральні властивості. Виділення культур стафілококів здійснюють за допомогою простих середовищ (МПБ та МПА), на які пастерівською піпеткою висівають гній, ексудат. Оптимальна температура росту 35–37⁰С, але можуть рости в межах 10–45⁰С. Аероби та факультативні анаероби. На МПБ через 24–48 год стафілококи обумовлюють інтенсивне помутніння та утворення значної кількості осаду. Можливе утворення сірувато-білого пристіночного кільця або плівки. На МПА через 12–24 год росту утворюють круглі, випуклі, соковиті, непрозорі колонії діаметром 2–4 мм. Колір їх залежить від виду стафілококу і пігменту, що ним виробляється: золотистий, кремовий, лимонно-жовтий, білувато-сірий. При дослідженні патологічного матеріалу для посіву необхідно користуватись селективним середовищем – сольовим кров’яним МПА (МПА з 8–10% NaCl і 5% дефібринованої крові). Застосування цього середовища основане на здатності стафілокока витримувати високі концентрації солі (до 16%). Інші види мікробів в таких умовах не ростуть. Патогенні стафілококи на кров’яному МПА навколо колоній утворюють прозору зону гемолізу.

Певне діагностичне значення має здатність стафілококів рости на МПА з кристалічним фіолетовим, на якому патогенні види утворюють колонії фіолетового або оранжевого кольору, ріст непатогенних стафілококів пригнічується.

Ферментативна (біохімічна) активність – їх визначення має особливе діагностичне значення. Окремі біохімічні властивості враховують як фактори патогенності. Стафілококи володіють протеолітичними властивостями: розріджують стовбчиком желатину (МПЖ), розріджують звернуту кров’яну сироватку, звертають молоко і пептонізують згусток казеїну, що утворився. Важливе діагностичне значення має визначення реакції плазмокоагуляції та ДНК-азної активності.

Реакцію плазмокоагуляції ставлять у пробірках, що містять цитратну сироватку крові кролів. Досліджувану культуру висівають і інкубують при 37⁰С. Патогенні стафілококи через 2–10 год коагулюють плазму. Якщо пробірки залишити довше у термостаті, то під дією фібринолітичного ферменту згусток плавиться.

ДНК-азну активність визначають на МПА з розчином натрієвої солі ДНК в чашках Петрі. Після 18–20 год культивування у чашку додають соляну кислоту і через 2–3 хв зливають. Навколо колоній патогенних видів утворюється прозора зона, що свідчить про продукування ДНК-ази.

Стафілококи мають також цукролітичні властивості: ферментують (розщепляють) до кислоти лактозу, глюкозу, сахарозу, гліцерин, маніт. Ферментація маніту властива патогенним видам.

Для виявлення патогенності стафілококів застосовують біологічну пробу на кролях та кошенятах. Для виявлення дермонекротоксину бульйонну культуру стафілококу вводять у товщу шкіри кролю в дозі 0,2 мл. В позитивних випадках через 24–48 годин спостерігається некроз шкіри.

Наявність летального токсину можна доказати шляхом внутрішньовенного введення фільтрату бульйонної культури стафілокока кролям в дозі 0,75 мл на 1 кг маси тіла. Під дією названого токсину тварини гинуть через 15 хв.

В окремих випадках (при отруєннях) для виявлення ентеротоксину кошенятам перорально (з молоком) вводять фільтрат вбитої культури. При наявності ентеротоксину через 1–2 год у тварин виникають симптоми гастроентериту та блювання.

Таким чином, заключний бактеріологічний діагноз оснований на врахуванні описаних характерних морфологічних, тинкторіальних, культурально-біохімічних та патогенних властивостей виділеної з патологічного матеріалу культури стафілококів.

Для патогенних стафілококів характерні: гемоліз, ферментація маніту, ДНК-азна активність, ріст у середовищі з додаванням кристалвіолету, реакція плазмокоагуляції, некротизуюча здатність, наявність летального токсину.