Синтез амінокислот.

Замінні амінокислоти у тварин можуть синтезуватися наступними шляхами (напишіть відповідні реакції):

1. Амінування кетокислот

2. Пере амінування:

а) кетокислота і амінокислота

б) кетокислота і аспарагін і глютамін

3. Шляхом перетворення амінокислот.

Лабораторне заняття.

Робота 1. Кольорові реакції на білки і амінокислоти.

1. Біуретова реакція. Обумовлена наявністю пептидних зв’язків в молекулі білку, дякуючи яким в лужному середовищі з солями міді білок утворює кольорову комплексну сіль.

До 1 – 2 мл розчину білку добавити 1 – 2 мл 10%-вого розчину лугу і 1-2 мл 1%-вого розчину СuSO₄ . З’явиться фіолетовий колір. Цю реакцію можуть давати полі- і дипептиди, але з іншими відтінками забарвлення (червоно-фіолетовий і ін.)

2. Ксантопротеїнова реакція. Ґрунтується на здатності присутніх у молекулі білку ароматичних амінокислот (тирозин, триптофан і феніланін) утворювати з кріпкою НNO₃ при підігріванні жовтозабарвлені нітроз’єднання.

До 2-3 мл розчину білку прилити 0,5-1 мл концентрованої НNO₃. Випадає осадок, який при підігріванні набуває жовтого забарвлення. Якщо після охолодження в пробірку добавити 1-2 мл концентрованого лугу або аміаку, жовте забарвлення переходить в жовто-оранжове внаслідок перетворення нітропохідних циклічних амінокислот в солі хіноїдної структури.

3. Реакція на триптофан. До 2-3 мл розчину білку прилити надлишок крупкої НСl і нагріти (не доводячи до кипіння, щоб не випаровувався хлористий водень). Білок, який випав при добавленні кислоти в осадок, при нагріванні розчиняється, і рідина набуває фіолетового забарвлення. Ця реакція вказує на наявність в білку не тільки триптофану, але і вуглеводів: триптофан реагує з оксиметилфурфуролом який утворюється із моносахаридів, в результаті чого виникає з’єднання фіолетово-червоного забарвлення.

4. Реакція з оцтовим свинцем. Позитивна реакція указує на наявність в білковій молекулі слабозв’язаної сірки цистеїну і цистину.

1-2 мл розчину білку кип’ятити 2-3 хвилини, з подвійним об’ємом 10%- вого розчину NOH, потім добавити 1-2 краплі 5%-вого розчину оцтовокислого свинцю. Випадає чорний осад PbS. Реакція проходить за наступними рівняннями:

R – SH +2NOH→Na₂S+R – OH+H₂O

^цистин

Na₂S+(CH₃COO)₂Pb→↓ PbS+2CH₃COONa

5. Нінгідрована реакція. Указує на присутність в амінокислотах -аміногруп. До 0,2-0,5 мл розчину амінокислоти або гідролізу білку добавити 2-3 краплі 0,1% - вого ацетонового розчину нітрогену, кип’ятити 2 хвилини. З’являється синє-фіолетове або розово-фіолетове забарвлення внаслідок взаємодії двох молекул нінгідрину з молекулою аміаку, який утворюється із – NH₂-групи.

Робота 2. Реакція осадження білку.

Білки, подібно іншим колоїдним системам, під впливом різних взаємодій, легко випадають із розчину в осадок. Часто приходиться звільняти від білків біологічні рідини (кров, молоко) або різні екстракти, наприклад із мозку, печінки і т.д. Для цього застосовуються різні способи осадження. Оскільки розчини білків мають властивості гідрофільних колоїдів, то для кількісного їх осадження необхідно усунути обидва фактори стійкості – зруйнувати захисну водну оболонку і зняти електричний заряд. Існує значна кількість різноманітних методів осадження білку і методи зазвичай діляться на дві групи. Перша група – це оборотні реакції осадження. При цих реакціях молекула білку зберігає свої нативні властивості і одержані осадки білків можуть знову бути розчинені в первісному розчиннику. До оборотних реакцій осадження відносяться більшість реакцій висолювання білків, а також осадження різноманітними водовіднімаючими реактивами (спирт, ацетон) при короткочасній їх дії за низької температури.

Друга група реакцій осадження складається із необхідних реакцій, при яких білки зазнають глибоких змін і не можуть бути знову розчиненні в первісному розчиннику (осадження солями важких металів, алкалоїдними реактивами, концентрованими мінеральними кислотами, нагріванням). В цих випадках відбувається денатурація білку, тобто глибокі зміни білку, при яких він втрачає свої нативні властивості.

Висолювання білків.

Висалюванням білків називається осадження з допомогою звичайної кількості солей лужних і лужноземельних металів (зазвичай використовуються (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, NaCl, MgSO₄) Для висалювання різноманітних білків потрібна різна концентрація одних і тих же солей. Наприклад глобуліни осаджуються при 50%-вому насиченні розчину сульфіту амонію, а альбуміни – при 100%-вому насиченні. Отже, створюючи відповідну концентрацію солей, можна виділити різноманітні білки.

Висалювання сірчанокислим амонієм.

В пробірку налити близько 3 мл розчину білку або сироватки крові, добавити рівний об’єм насиченого розчину сірчанокислого амонію і перемішати. Отримаємо полу насичений розчин, в осадок випадає глобулін. Через декілька хвилин глобулін відфільтрувати. В фільтраті залишається інший білок – альбумін. Для висалювання альбуміну в фільтрат добавити тонко подрібнений порошок сірчанокислого амонію до насичення, тобто до тих пір, доки нова порція порошку залишиться не розчинною. Альбумін який випав в осадок, відфільтрувати. З фільтратом провести біуретову реакцію (див. с. 35). Негативна реакція показує на відсутність білку в розчині, тобто на повне його осадження.

Робота 3. Згортання білків при нагріванні.

В 5 пробірок налити по 2 мл розчину білку.

1. Нагріти вміст першої пробірки. Осадок з’явиться ще до того, як рідина закипить.

2. Добавити в другу пробірку 1 краплю 1%-вого розчину оцтової кислоти і нагріти. Пластівчастий осадок білку випадає скоріше і повніше, ніж в першій пробірці.

3. Добавити в третю пробірку близько 0,5 мл 10%-вого розчину оцтової кислоти і нагріти. Осадок білку не утворюється навіть при кип’ятінні.

4. В четверту пробірку добавити близько 0,5 мл 10%-вого розчину оцтової кислоти, декілька крапель насиченого розчину хлориду натрію і нагріти. Утворюється осадок білку.

5. В п’яту пробірку добавити близько 0,5 мл розчину гідроксиду натрію інагріти. Осадок не утворюється навіть при кип’ятінні. Поясніть ці явища.

Робота 4. Виділення муцини із слини.

Муцин знаходиться в слині, в слизі травного тракту і інших органів. Муцин – білок з кислими властивостями, нерозчинний у воді, але добре розчинний в лугах і соляній кислоті. Із лужного розчину муцин звільняються оцтовою кислотою, надлишок якої не розчиняє муцин.

В дві пробірки зібрати по 1-2 мл слини і добавити до кожної по краплях 1%-вий розчин оцтової кислоти До появи згустків муцину. Осадок муцину в пробірках обережно промити водою, притримуючи згусток паличкою. Після промивання згустку муцину до першої пробірки добавити 1 мл 10%-вого розчину гідроксиду натрію, розмішати і після розчинення провести біуретову реакцію (див. с. 35). В другу пробірку 1 мл 0,1%-вого розчину соляної кислоти і спостерігати розчинення осадку.

Робота 5. Дослідження дії пепсину.

Для досліду взяти 5 пробірок і в чотири із них відміряти по 2 мл 0,1%-вого розчину пепсину в 0,2%-вому розчині соляної кислоти або по 1 мл шлункового соку. Вміст другої пробірки нейтралізувати за лакмусом 1%-вим розчином соди, вміст третьої пробірки підлужити 0,4%-вим розчином лугу. Вміст четвертої пробірки кип’ятити протягом 2-3 хвилин для інактивації ферменту. В п’яту пробірку відмірити 1 мл 0,2%-вого розчину НCl. Потім у всі п’ять пробірок добавити одинакові шматочки фібрину і помістити їх в термостат при 38⁰ – 40⁰.

Через 30 – 45 хвилин пробірки витягти із термостату і відмітити зміни які відбулися в них. Потім відфільтрувати вміст всіх пробірок і з фільтратом зробити біуретову реакцію (с. 35).

Результати досліджень занести в таблицю.

№ проби	Склад проби	Зміни фібрину	Біуретова реакція
1
2
3
4
5

Зробити висновки, в яких умовах переварювання білку пепсином іде інтенсивніше.

Робота 6. Переварювання білків ферментами підшлункової залози.

Для досліду взяти три пробірки: в першу відмірити 2 мл розчину панкреатину, в другу – 2 мл розчину панкреатину, підкисленого соляною кислотою. У всі пробірки помістити по однаковому шматочку фібрину і пробірки поставити в термостат при 38⁰ - 40⁰.

Через 40⁰ – 60⁰ хвилин пробірки витягти із термостату і спостерігати змінення фібрину (його розчинність). Відфільтрувати вміст кожної пробірки і з фільтратом зробити біуретову реакцію. Результати досліду занести в таблицю.

№ проби	Склад проби	Змінення фібрину	Біуретова реакція
1
2
3

В яких умовах дія панкріотину на білок ефективніша?

Робота 7. Якісні реакції на креатинін.

Реакція Яффе. При взаємодії креатині ну з пікриновою кислотою в лужному середовищі утворюється пірат креатину оранжево-червоного забарвлення.

В мікрохімічній пробірці змішати 3 – 4 краплі сечі, 2 краплі розчину пікринової кислоти і стільки ж крапель розчину їдкого натру. З’являється оранжево червоне забарвлення.

Реакція Вайля. Креатинін при взаємодії з нітропрусидом в лужному середовищі перетворюється в нітрозокреатинин червоного забарвлення. Таке ж забарвлення при обробці нітропрусидом дає ацетон. Для того, щоб відрізнити реакції, які дають креатинін і ацетон, необхідно знати наступне:

1. Забарвлення, яке дає креатинін, швидко зникає, а забарвлення, яке дає ацетон, стабільне.

2. При добавленні оцтової кислоти червоний нітрозодобуток креатині на знебарвлюється, а яке дає ацетон, навпаки, посилюється.

До 5 крапель сечі добавити декілька крапель свіжо-приготовленого розчину нітропрусиду натрію і потім 1 краплю розчину їдкого натру. Виникає червоне забарвлення, яке постоявши, переходить в жовте. Перехід червоного забарвлення в жовте може прискорити, добавивши декілька крапель оцтової кислоти.

Робота 8. Вивчення вільних амінокислот методом розподільної