Работа № 3. Фотоэлектроколориметрия.

Принцип метода: фотометрия основана на измерении поглощения света определенной длины волны проходящего через исследуемый раствор. Окрашенные растворы образуются после проведения цветных реакций, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации определяемых веществ. Цифровые величины, регистрируемые фотоэлектроколориметром на шкале оптической плотности прибора (нижняя шкала), отражают экстинцию (Е) – оптическую плотность.

Ход работы:

1. Знакомство с прибором и прилагаемой к нему инструкцией.

2. Определение экстинции опытного (Еоп) и стандартного (Ест) растворов и перевод

экстинции в концентрации (Соп и Сст) с помощью калибровочного графика, построенного по нескольким стандартным концентрациям изучаемых веществ. Если график окажется прямолинейным, то для простоты можно произвести расчет опытной концентрации (Соп) исходя из значения одной стандартной концентрации (Сст) по формуле: СОП = ССТ • ЕОП/ЕСТ

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

1. Название работы

2. Принцип метода

3. Полученные результаты

4. Выводы. Клинико-диагностическая оценка полученных результатов.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 29. 08. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено асс. Кротовым В.К.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

Методические указания к практическому занятию № 2 (для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Ферменты: строение и свойства.

2. Учебная цель занятия: Изучить особенности строения и основные свойства ферментов, методы определения их активности.

3. Задачи занятия:

1. на основе знаний по биоорганической химии систематизировать сведения о строении и основных свойствах белков, их биологической (каталитической) роли в организме.

2. изучить строение ферментов, знать отличия в строении простых и сложных ферментов, локализацию ферментов в клетке, изоферменты.

3. познакомиться с основными методами качественного обнаружения и количественного определения активности ферментов.

4. в ходе выполнения практической работы познакомиться с методами осаждения белков, обнаружить кофермент НАД в дрожжах, исследовать амилазную активность слюны.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. Часа.

5. Задание студентам:

1. Изучить денатурацию белков под действием растворов минеральных и органических кислот и при нагревании.

2. Обнаружить кофермент НАД в дрожжах.

3. Определить амилазную активность в моче (сыворотке крови).

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии. Работа № 1. Денатурация белков под действием кислот и при нагревании.

Принцип метода: денатурация - это нарушение структурной организации белковой молекулы, приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Большинство белков теряют биологическую активность в присутствии сильных минеральных и органических кислот, при обработке ПАВ, органическими растворителями, солями тяжелых металлов и под действием физических факторов (температура, ультразвук, радиация). Денатурации предшествует нарушение гидратной оболочки и снятие заряда белка, в силу чего он становится менее гидрофильным и легко осаждается.

Ход работы:

1). Осаждение белка минеральными кислотами.

В пробирку наливают 15-20 капель концентрированной азотной кислоты (HNO₃) и осторожно по стенке приливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде небольшого белого кольца.

2). Осаждение белка органическими кислотами.

В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и добавляют 3-5 капель 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Образуется осадок белка.

3). Осаждение белка при нагревании.

В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и содержимое пробирки нагревают над спиртовкой, Жидкость мутнеет.

Клинико-диагностическое значение.

Осаждение белка с помощью ТХУ широко используется в клинической практике для обнаружения белка в биологических жидкостях (моча, экссудаты и др.).

В клинической практике выполнению анализа сыворотки крови на содержание малых молекул (глюкоза, мочевая кислота и т.д.) предшествует осаждение белков действием минеральных кислот или ТХУ.

Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимого осадка используется как противоядие при отравлениях солями тяжелых металлов.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

В выводах отразить причины осаждения белков из растворов, влияние денатурирующих факторов на активность ферментов.