67

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

Методические указания к практическому занятию № 1 (для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Введение в биохимию, современные методы исследования.

2. Учебная цель занятия: Ознакомиться с предметом биохимии, методами и техникой лабораторных работ.

3. Задачи занятия:

1. Получить представление о предмете биохимии: целях, задачах, областях применения, основных достижениях; о структуре предмета и практических занятиях, правилах техники безопасности и культуре поведения в лабораториях кафедры.

2. Изучить методику получения биологического материала: плазмы, сыворотки крови, гомогената и экстрактов тканей, органелл клеток, клеток тканей.

3. Научиться работать на центрифуге.

4. Провести исследование содержания аминокислот в плазме крови, методом хроматографии.

5. Научиться работать на фотоэлектроколориметре.

6. Ознакомиться с принципом действия биохимического анализатора, его возможностями и спектром применения.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Получение плазмы крови методом центрифугирования.

2. Тонкослойная хроматография аминокислот плазмы крови.

3. Фотоэлектроколориметр: принцип метода, техника работы на приборе.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Получение плазмы крови методом центрифугирования.

Принцип метода: Принцип центрифугирования основан на том, что клетки крови осаждаются в центробежном поле. Скорость сендиментации (осаждения) зависит от плотности раствора, молекулярной массы, формы, размеров осаждаемых частиц (органелл или клеток и др.).

Ход работы: Цитратная кровь, приготовленная лаборантами, наливается в центрифужную пробирку 1,0 мл, а в противовес ей готовят центрифужную пробирку с 1,0 мл воды. Обе пробирки устанавливают в противоположные гнезда ротора центрифуги. Закрывают крышку центрифужной камеры и включают центрифугу на 5 минут, плавно разгоняя ротор до 3000 об/мин. По окончании центрифугирования, при полной остановке ротора, открывают крышку и достают пробирки. Полученная плазма крови или образующаяся при центрифугировании гомогенатов тканей надосадочная жидкость используется для хроматографии аминокислот в работе № 2.

Работа № 2. Тонкослойная хроматография плазмы крови.

Принцип метода: Тонкослойная хроматография основана на различии в степени адсорбции разделяемых веществ микропористым адсорбентом (окись алюминия и др.) и их растворимости в растворителе.

Ход работы:

1. а) Каплю плазмы капилляром нанести на линию старта хроматографической полоски и сушить на воздухе 2-3 минуты. б) Каплю смеси эталонных образцов (фен и глу) капилляром нанести на линию старта другой полоски, и просушить 2-3 минуты.

2. Обе полоски поместить в хроматографические камеры (большие пробирки), погружая их на 2-3 мл в растворитель (вода:бутанол:ацетат) на 60 минут для хроматографического разделения.

3. По окончании разгонки отмечают фронт распространения растворителя и сушат в термостате 3-5 минут.

4. Хроматографические полоски проявляют нингидрином, дающим с аминокислотами цветную реакцию и вновь сушат в термостате до появления ярко выраженных цветных пятен. Наличие аминокислот может быть идентифицировано с помощью коэффициента распределения (Rf): Rf = a/b, где a – расстояние пройденное аминокислотой от линии старта, b – расстояние пройденное растворителем от линии старта.

Данный метод должен проводиться с соблюдением всех условий, указанных в справочнике: температура, время разгонки, растворитель. По этому наиболее простым и применимым является метод эталонных образцов (метод «свидетелей»), который заключается в том, что исследуемая смесь аминокислот и известные аминокислоты («свидетели») наносятся на линию старта одновременно и разгоняются в одинаковых условиях.