Работа № 2. Фосфоролиз гликогена и открытие фосфорной кислоты.

Ход работы:

1. Извлечение активного фермента - гликогенфосфорилазы.

0,5 г сырой печени поместить в ступку, добавить 4 мл фосфатного буфера и 4 мл р-ра NaF, ( для предотвращения утилизации Гл1ф ), растереть пестиком до гомогенного состояния, при этом фермент перейдет в раствор.

2. Проведение фосфоролиза.

В две чистые пробирки поместить по 2 мл гомогената, содержащего активный фермент. В первую пробирку(опыт) добавить 2 мл фильтрата или раствора гликогена, во вторую пробирку ( контроль ) добавлять ничего не нужно.

Обе пробирки термостатировать в течение 40 минут при температуре 39 градусов. В это время в опытной пробирке идет фосфоролиз с использованием фосфорной кислоты, а в контрольной нет, так как она не содержит субстрата – гликогена.

По истечении инкубационного времени в контрольную пробирку внести 2 мл р-ра

гликогена и в обе пробирки по 2 мл 20% раствора ТХУ к-ты. Все оставить на 5 мин.

при комнатной температуре для денатурации белков и остановки реакций. Растворы обеих пробирок отфильтровать в чистые пробирки с последующим проведением в них цветной реакции на фосфорную кислоту, по приведенному ниже в таблице составу реакционной смеси.

Реагенты ( мл).	Пробирки.
	Опыт.	Контроль.
Безбелковый фильтрат	2,0	2,0
Молибдат аммония	1,0	1,0
Эйконоген	0,1	0,1

Через 2 минут инкубации при комнатной температуре сравнить интенсивность окраски в опыте и контроле, сделать вывод о наличие функционирующего фермента, указать значение для организма фосфоролиза.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 04. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено доц. Трубачевым С.Д.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

Методические указания к практическому занятию № 9 (для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Анаэробный и аэробный распад моносахаридов.

2. Учебная цель занятия: Разобрать основной путь катаболизма моносахаридов в анаэробных и аэробных условиях, биохимические причины и механизмы их возможных нарушений.

3. Задачи занятия:

1. Изучить: последовательность реакций гликолиза, их биологическое значение, классификацию и номенклатуру ферментов, катализирующих эти реакции, ключевые реакции и реакции гликолитической оксидоредукцииреакции, реакции взаимосвязи гликолиза с циклом Кребса и окислительным фосфорилированием, механизмы регуляции регуляторных ферментов

2. Выявить общие метаболиты и узлы интеграции гликолиза с другими метаболическими путями и оценить его метаболическое и физиологическое значение.

3. Рассмотреть биохимические причины, механизмы и диагностику симптомокомплексов повреждения реакций гликолиза, обмена галактоза и фруктозы.

4. Ознакомиться с методами исследования функционального состояния гликолиза, их диагностической ценностью, самостоятельно выполнить исследование активности ЛДГ и определить содержание молочной кислоты в сыворотке крови.