Полвмеразна ланцюгова реакція

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), або метод ампліфікації генів дає змогу розмножувати задані ланцюжки ДНК у значній препаративній кількості. Вона може бути застосована також для індикації специфічних ДНК у судово-медичному дослідженні, в лабораторній діагностичній практиці, у тому числі в бактеріології та вірусології. Мова іде про індикацію тих нуклеїнових кислот, структура яких вивчена.

В основу ПЛР покладено відкриття ферменту ДНК-полімерази, розробка методу секвеніювання молекули ДНК, а також синтез олігонуклеотидів різної довжини та специфічності (праймерів).

ДНК-полімераза здатна подовжити короткі олігонуклеотидні затравки (праймери), додаючи до їх 3’-кінця наступний, додатковий, нуклеотид. Для цього необхідний праймер, гібридизований з комплементарним ланцюгом ДНК, яка є матрицею. Як правило, пошук ДНК-матриці і є завданням ПЛР.

Розчин, де відбувається ПЛР, має містити в достатній кількості нуклеотиди, ДНК-полімеразу, специфічні олігонуклеотиди й клінічний матеріал, у вигляді виділеної з нього ДНК. Усі ці компоненти ПЛР утримують в одній пробірці, температурний режим їх послідовно змінюють. Так, у разі діагностики ВІЛ-інфекції:

• при 94^оС відбувається денатурація досліджуваної ДНК;

• при 37 ^оС до обох розплетених ниток за принципом комплементарності приєднуються затравки (процес “відпалювання праймерів”);

• при 72 ^оС tag-ДНК-полімераза (фермент отримано з термофільних бактерій Thermophylus aguaticus) подовжує праймери до заданого розміру вірусного геному.

Як результат у пробірці замість 2 ниток вірусної ДНК з’являються 4. Цикл повторюють, кількість копій вірусу знову подвоюються і так далі. За 40 циклів ампліфікації кількість копій ДНК збільшується в 10¹³ разів. Таку кількість ДНК вірусу тепер можна ідентифікувати будь-яким відомим методом (наприклад, за допомогою електрофорезу в поліакріламідному гелі – ПААГ).

Питання до індз

01. Проаналізуйте в порівнянні морфологію, хімічний склад та біологічні властивості вірусів, віроїдів та пріонів.

Визначте механізм зараження людини при гепатитах вірусного походження. Наведіть приклади

02. Охарактеризуйте основні методики лабораторної діагностики вірусних інфекцій та поясніть, яку інформацію можливо отримати за їх допомогою

03. Перелічите основні вірусологічні методи досліджень. Яке, на Вашу думку, значення в сучасній практиці мають мікроскопічні методи.

Дайте визначення поняттю «клітинна культура». На яких етапах лабораторної діагностики може бути використано цю систему.

04. Порівняйте механізми, шо лежать у основі трьох популярних методів вірусологічних досліджень – полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), імуноферментного аналізу (ІФА) і реакції гальмування гемаглютинації (РГГА).

05. Поясність механізм переходу у хронічний стан хвороби, викликаної вірусами герпесу.

Визначте, у чому полягають основні механізми патогенної дії вірусів.

06. Поясніть, яке значення для вірусів та для людини має поділ вірусних геномів на окремі фрагменти (фрагментування геномів).

Дайте визначення поняття «інфекційна доза». Вкажіть, який зв'язок має це поняття з поняттям „титр вірусів”

07. Вкажіть на основні джерела формування нових типів вірусів

Дайте характеристику реакції імунної системи на вірусну інфекції. Яке місце у цьоиу процесі займають фактори неспецифічного імунітету

08. Поясніть, як відбувається процес репродукції вірусів Епштейна-Барр.

Розкрийте значення інкубаційного періоду у вірусному онтогенезі. Вкажіть, які процеси відбуваються у цей час в організмі

09. Подайте свою думку щодо використання різних типів противірусних вакцмн. У чому полягають позитивні та негативні властивості вакцин різних типів (рекомбінінтних, фіксованих, послаблених)

00. Вкажіть на основні шляхи проникнення вірусів в організм людини. Наведіть приклади.

Перелічить основні мішені при дії антиретровірусних препаратів