Тема. Цитологический рисунок. Измерение объектов под микро­скопом.

Цель работы: ознакомиться с устройством рисовального аппарата, окуляра и объект-микрометра.

Материал и оборудование: микроскопы, рисовальный аппарат РА-4, оку­ляр и объект-микрометр, материал для исследований, осветители ОИ-9М, ОИ-34.

Ход работы

1. Зарисовка препаратов

Зарисовка препаратов является необходимым моментом любого цитогенетического исследования. Как рисунок, так и фотография представляют документ, подтверждающий и иллюстрирующий полученные данные. Здесь мы остановимся лишь на зарисовке.

При зарисовке чаще всего пользуются рисовальным аппаратом Аббе. Основной частью этого прибора является призма, которая укрепляется на тубусе микроскопа. С помощью стержня призма соединена с зеркалом. Лучи света, проходящие из окуляра, попадают на посеребренную поверхность, грань которой расположена по отношению к лучам под углом 45°. На зер­кальной грани находится узкая прозрачная полоса, через которую часть лу­чей попадает в глаз исследователя и дает изображение объекта (рис. 4).

Рядом с микроскопом располагают лист бумаги. Над ним находится зеркало, расположенное под углом 45° по отношению к бумаге и к зеркаль­ной призме рисовального аппарата. Лучи, отраженные бумагой, преломляют­ся зеркалом на 90°, попадают на призму и, еще преломляясь на 90°, попадают к глазу наблюдателя. В результате исследователь одновременно видит объект и бумагу, на которой он будет делать рисунок. Остается только остро отто­ченным карандашом обвести контуры объекта. При этом кончик карандаша и объект должны быть одновременно четко видны. Если объект освещен силь­нее, то карандаш плохо виден или совсем не виден. Если слишком сильно освещена бумага, то виден карандаш, но не виден объект. Нужно добиться такого освещения, когда хорошо видны и кончик карандаша и объект. Первое достигается изменением освещенности бумаги за счет приближения или уда­ления лампы. Изменение освещенности объекта достигается регулировкой силы тока осветителя или с помощью фильтров рисовального аппарата, кото­рые помещаются между окуляром микроскопа и призмой.

Для получения изображения, соответствующего линейному увеличе­нию при данном объективе и окуляре, необходимо делать рисунок на уровне столика микроскопа.

2. Измерение объектов

Величина объектов - клеток, хромосом - измеряется единицами длины -микрометрами (мкм). Кроме абсолютной величины объектов в цитологических исследованиях используется показатель «линейное увеличение» - отношение величины изображенного на рисунке объема, выраженной в единицах длины, к абсолютной величине объекта, выраженной в тех же единицах.

Определение абсолютной величины объекта и его линейного увеличе­ния проводят с помощью объект-микрометра и рисовального аппарата.

Объект-микрометр представляет собой пластинку с нанесенным на ней кругом, в центре которого имеется шкала длиной 1 мм с делениями. Цена одного деления объект-микрометра дана на пластинке (рис. 5).

Рис. 5. Объективный (слева) и окулярный (справа) микрометры

На листе бумаги с помощью рисовального аппарата наносят изображе­ние шкалы и получают масштаб, одно деление которого соответствует цене деления объект-микрометра. Этим масштабом можно пользоваться как ли­нейкой при измерении объектов, изображенных с помощью рисовального аппарата. Измерение можно проводить лишь при том же увеличении микро­скопа, при котором было получено изображение шкалы. В случае замены объектива или окуляра другим необходимо получить новую шкалу.

При установлении линейного увеличения объекта величину объекта, полученную при помощи рисовального аппарата и выраженную в единицах длины, делят на его абсолютную величину, определенную объект-микромет­ром и выраженную в тех же единицах. Например, получаем изображение клетки, величина которой на рисунке 1,2 см. При измерении с помощью масштабной линейки длина её равняется 8 делениям, т.е. 80 мкм при цене деления 10 мкм. В данном случае линейное увеличение объекта получим при делении 1,2/80 мкм, т.е. равное 15.

Определение величины объекта можно проводить с помощью окуляр-микрометра (рис. 5). Окуляр-микрометр представляет собой круглую стек­лянную пластинку, которая вставляется в окуляр микроскопа. На пластинке окуляр-микрометра, как и на объект-микрометре, находится шкала. Для из­мерения объектов необходимо определить цену одного деления окуляр-микрометра. Для этого вместо препарата берут объект-микрометр, где из­вестна цена одного деления, и определяют цену деления окуляр-микрометра при данном увеличении. Для этого добиваются совпадения шкал окуляр - и объект-микрометров, затем отсчитывают число делений окуляр-микрометра, точно совпадающих с каким-то числом делений объект-микрометра. Разде­лив абсолютное значение этого участка шкалы объект-микрометра на число делений окуляр-микрометра, получаем цену деления. Например, если совпа­дают 9 делений объект-микрометра и 15 делений окуляр-микрометра, то рас­чет проводят следующим образом. Длина участка объект-микрометра равна 10 мкм х 9=90 мкм (при цене деления 10 мкм). Цена одного деления окуляр-микрометра в этом случае равна 90 мкм: 15, т.е. 6 мкм. После этого объект-микрометр заменяют препаратом и проводят измерения необходимых объек­тов. При замене объектива или окуляра необходимо заново определять цену деления окуляр-микрометра.

Для измерения площади отдельных клеток или тканей на листе бумаги зарисовывают контуры клеток или определенного участка ткани. Затем зари­совывают участок величиной в 1 см2, вырезают его, взвешивают и вес при­нимают за 1. С весом этого участка сопоставляют веса отдельных клеток. Этот метод дает неплохие результаты, он довольно прост и точен.

Задание. Установив на столе микроскоп МБИ-3 или МБР-1, добиться рационального освещения препарата по Келлеру, подобрав необходимые све­тофильтры. Далее, воспользовавшись измерительным окуляром и объект-микрометром, провести определение цены деления окуляр-микрометра и за­писать результаты в таблицу.