Временные препараты. Перевод их в постоянные Фиксация, хранение и мацерация объектов

В микроскопической технике широко применяют временные дав­леные препараты, для изготовления которых не нужны сложная процедура обезвоживания, заключение в промежуточную жид­кость, в парафин и получение микротомных срезов.

Давленые препараты необходимы при изучении митоза, кариотипов, хромосомных нарушений в корешках и конусах нара­стания стеблей, мейоза в молодых пальниках.

Наиболее часто для изготовления давленых препаратов ис­пользуют фиксаторы Кариуа (6:3: 1), Ныокомера (6:3:1:1:1), Баталья (5:5:1:1), уксусный алкоголь (3: 1), ледяную уксус­ную кислоту и др. Когда трудно считать хромосомы или они длинные, применяют специальные методы предобработки, о кото­рых было сказано выше (см. с. 60). Так, для кариологического анализа корни скерды зеленой перед фиксацией обрабатывают 0,05%-м раствором колхицина обычно в течение 2 ч. Кроме колхицина, можно брать насыщенные растворы парадихлорбензола или 0,002 М 8-оксихинолина. Эти два раствора готовят в термо­стате при 60°С. Для предобработки корней перед фиксацией хорошие результаты дает насыщенный в воде раствор монобром-нафталина. Для подсчета числа хромосом возможна фиксация корней при пониженной температуре (2-3°С).

Фиксированный материал хранят в холодильнике в фиксаторе или промывают в 96%-м растворе этилового спирта и хранят в 70%-м его растворе до окрашивания.

При изготовлении давленых препаратов исключительное зна­чение имеют способы мацерации тканей до окрашивания (лат. maceratio - размягчение; в данном случае обработка объекта, чтобы вызвать распад ткани на отдельные клетки). Обычно для этого используют 45%-ный раствор уксусной кислоты (для твер­дых объектов ее подогревают), 40-45%-й - пропионовой кисло­ты, 1 н. раствор соляной кислоты, различные энзимы (пектиназа, цитаза) и др. Окрашивают препараты ацетокармином, ацетоорсеином, пропионовым гематоксилином и др.

Ниже приведены наиболее распространенные методы приго­товления красителей и окрашивания давленых препаратов.

Окрашивание препаратов

Окрашивание ацетокармином, ацетоорсеином, ацетолакмоидом и метиленовой синей.

Приготовление красителей.

Ацетокармин. Наиболее распространен следу­ющий метод. Растворяют 1 г (лучше 2-4 г) кармина - красящего вещества, состоящего из карминовой кислоты, - в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение ведут в колбе с обратным холо­дильником на водяной бане с подогревом около 3 ч. При отсутствии обратного холодильника в колбу вставляют воронку. После остывания темно-красный ра­створ кармина фильтруют и помещают в посуду с притертой крышкой. Для работы его наливают в капельницы. Остатки кармина на фильтре можно ис­пользовать повторно.

Можно готовить кармин по методу Сноу на этиловом спирте с добавлени­ем НС1. Для этого 4 г кармина сначала растворяют в 15 мг горячей воды и добавляют 1 мл HG1. Остывшую смесь разбавляют 95 мл 85%-го раствора спирта и фильтруют.

Ацетоорсеин. Готовят орсеин из орсина - красящего начала природной краски, получаемой из лишайника. Растворяют 1 г орсеина в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавляют 55 мл дистиллированной воды, кипятят на во­дяной бане 3 ч, остужают и после фильтрации раствор готов к употреблению.

Ацетолакмоид. Растворяют 2 г лакмоида в 100 мл 45%-го раствора уксус­ной кислоты и кипятят 2 ч в колбе с обратным холодильником. После испаре­ния добавляют уксусную кислоту до первоначального объема. Раствор исполь­зуют после фильтрации.

Метиленовая синяя. 100-500 мг краски растворяют в 100 мл дистилли­рованной воды.

При использовании всех этих красителей в качестве фикса­тора для корней чаще всего применяют уксусный алкоголь (3: 1). Если для окрашивания берут ацетоорсеин, ацетокармин или ацетолакмоид, объекты помещают в раствор одного из них, подогревают на спиртовке, доводят до легкого кипения несколько раз, особенно если не была проведена мацерация в НС1.

Корни злаков труднее окрашиваются и мацерируются, поэто­му приходится увеличивать время их окрашивания. Так, корни ячменя, пшеницы иногда выдерживают в ацетоорсеиие от.одних до полутора суток при комнатной температуре.

После этого объект кладут на предметное стекло в каплю 45%-го раствора уксусной кислоты или хлоралгидрата (5 г хлор­алгидрата растворяют в 2 мл дистиллированной воды), отделяют конус нарастания, удаляют лишние ткани, накрывают покровным стеклом и фильтровальной бумагой и постукивают сверху спич­кой, чтобы уложить клетки конуса нарастания в виде монослоя.

Описанный метод приготовления красителей и препаратов применяют в различных модификациях. Так, можно сохранять фиксированный материал в свежем фиксаторе при температуре 0-3°С, а окраску и мацерацию объектов вести в смеси растворов 2%-го ацетоорсеина и 1 н. НС1 в соотношении 9:1 при подо­гревании или воспользоваться 4%-м ацетолакмоидом и 1 н. НС1 (9:1) для мацерации и окраски с последующим перенесением объектов в ацетолакмоид. В некоторых случаях фиксированный материал сохраняют в 70%-ном растворе спирта при температу­ре 0-3°С и окрашивают в ацетокармине с добавлением железа.

Иногда материал мацерируют не в соляной кислоте, а в аце­токармине или ацетоорсеине, в которых его оставляют на ночь. В ацетолакмоиде материал можно держать двое суток, например корни гречихи.

Готовые препараты можно окантовать расплавленным пара­фином или превратить в постоянные при помощи сухого льда или жидкого азота (см. с. 103).

Пропионово-гематоксилиновый метод окра­шивания по Henderson и Lu. Перед окрашиванием объект мацерируют в 1 н. растворе НС1 от нескольких до 30 мин, промывают водой и на несколько минут помещают в 50%-ный раствор пропионовой кислоты.

Приготовление красителя. Растворяют 4 г гематоксилина в 10 мл 96%-го раствора этилового спирта, затем добавляют дистиллированную воду до 100 мл. Раствор оставляют открытым при комнатной температуре для созревания на 2-3 мес. Для ускорения созревания сосуд с раствором красителя можно поставить в термостат при 30-35 °С на сутки. Созревший раствор смешивают со 100 мл 50% -го раствора пропионовой кислоты. Допускается смешение све­жего раствора с пропионовой кислотой.

Отдельно готовят раствор железоаммоиийных квасцов в пропионовой кис­лоте. Для этого 1 г квасцов растворяют в 200 мл 50%-го раствора пропиоио­вой кислоты.

Известны четыре способа окрашивания. Приведем два из них. Первый способ используют при наличии незрелого раствора кра сителя: последний смешивают с квасцами (1:1) и используют через сутки или более. При втором способе к 1-2 каплям созрев­шего красителя добавляют квасцы (1 : 1) и помещают в эту смесь объект на предметное стекло.

Добавление насыщенного раствора ацетата железа в 50%-м растворе пропионовой кислоты способствует усилению окрашива­ния. Метод применялся для изучения хромосом льна, но исполь­зуется и в работе с другими объектами.

Окрашивание ацетофуксином. Окрашивают объ­екты в ацетофуксине в закрытых бюксах в течение 1-3 ч. Дав­леный препарат готовят в 30%-й уксусной кислоте, которая спо­собствует обесцвечиванию цитоплазмы. Хромосомы окрашивают­ся в темно-фиолетовый цвет.

Приготовление красителя. Растворяют 1 г основного фуксина в 50 мл 40%-го раствора уксусной кислоты. Раствор подогревают до 50°С для хоро­шего растворения фуксина, затем охлаждают до 25-30 °С и фильтруют. Объ­екты фиксируют в 45%-м растворе уксусной кислоты 10-30 мин при 15 °С. Затем помещают в горячий 1 н. раствор HCI на 15-30 с при 60°С.

Пропионово-л акмоидный метод окрашивания по Каптарю. Кончики корней длиной 2-4 мм помещают в пробирку с 5—10 каплями стандартного раствора на 1—2 ч. За­тем корни переносят в 0,5 мл 40%-ного раствора пропионовой кислоты, которую доводят до кипения в течение не более 5—30 с для мацерации объекта. После кипения корни переносят на пред­метное стекло в каплю 40%-го раствора пропионовой кислоты, накрывают покровным стеклом и давят на него. Подсчитывать хромосомы удобнее в корне не в зоне интенсивного деления, а в тех клетках, которые делятся тангентально и поэтому более удоб­ны для подсчета. Они располагаются обычно по периферии пре­парата.

Приготовление красителя. Для окрашивания временных препаратов с кор­нями или пыльниками растений готовят смесь такого состава: 5 г лакмоида до­бавляют к 50 мл 50%-го раствора пропиоповой кислоты. Полученный раствор ставят в темное место на 3-5 сут и время от времени встряхивают. Затем его фильтруют и используют в работе как стандартный раствор. Отдельно готовят 40%-й раствор пропионовой кислоты.

Хромосомы окрашиваются при таком способе в коричневый цвет. Контрастность хромосом увеличивается спустя полчаса после приготовления препарата.

Окрашивание реактивом Шиффа. Известны две модификации реакции Фёльгена для выявления ДНК: с холод­ным и горячим гидролизом объектов в соляной кислоте.

Приготовление красителя. При холодном гидролизе реактив Шиффа со­ставляют из 97,5 мл дистиллированной воды, 2,5 мл концентрированной соля­ной кислоты, 0,5 г фуксина основного для фуксииосернистой кислоты, 1,5 г метадисульфита калия (K2S2O5) или натрия (Na2S2O5). Составные части вносят в сосуд в указанном порядке без взбалтывания. Закрытый сосуд с реактивом помещают в темное место на двое суток для обесцвечивания раствора.

Подлежащий окраске материал из фиксатора или 70%-го рас­твора спирта переносят в I н. раствор НС1, а затем в разбавлен­ную соляную кислоту (1 ч. концентрированной HCl-f-1 ч. дистил­лированной воды) при комнатной температуре. Время гидролиза корней в HCI от 20 мин (для гороха) до 2 ч (для картофеля). В реактиве Шиффа корни держат 15 мин и более. Потом их переносят в 45%-й раствор уксусной кислоты. Готовят препарат в той же концентрации уксусной кислоты.

При горячем гидролизе реактив Шиффа готовят по методу. указанному выше. Порядок работы при этом способе следующий.

1. Материал из 70%-го раствора спирта сначала переносят на несколько секунд в холодный раствор 1 н. НС1, затем на несколько минут в раствор 1 н. HCl с температурой 60°С для горячего гидролиза (6-8 мин - для фиксатора Карнуа или уксусного алкоголя).

2. Снова переносят материал в холодный 1 н. раствор НСl на несколько секунд.

3. Переносят материал в реактив Шиффа на 0,5-1,5 ч (время устанавливают опытным путем).

4. Промывают материал в трех сосудах с сернистой водой по 5-10 мин в каждом.

5. Промывают материал в проточной воде, а затем в 40-45%-м растворе уксусной кислоты.

6. Готовят давленые препараты.

Переносить корни или пылинки из одной жидкости в другую удобно в небольших стеклянных цилиндрах без дна, затянутых с двух концов марлей.

После окрашивания реактивом Шиффа может возникнуть не­обходимость провести мацерацию растительных объектов. В этом случае, помимо уксусной кислоты, пользуются цитазой из зобной жидкости виноградных улиток.

Зобную жидкость извлекают из улиток Helix lucorutn iaurica, убитых быстрым замораживанием. Очищают ее центрифугирова­нием при 20 тыс. оборотов в минуту в течение 30 мин и хранят в замороженном состоянии при -4°С. Корни, окрашенные по Фёльгену, помещают сначала на фильтровальную бумагу, а за­тем в плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл. В про­бирки добавляют цитазу по 0,05 мл на 10 корней (кормовых бо­бов). Мацерация длится 20 ч при комнатной температуре.

Окрашивание нигрозином. Используют следующую методику мацерации и окрашивания объектов. Готовят смесь концентрированной соляной кислоты и 95%-го раствора этилово­го спирта (соотношения 1:4, 1:2, 1:1, в зависимости от мате­риала; для нежных объектов - 1:4). В мацерирующую жидкость при 10-15°С помещают объекты на 5-20 мин. После промывки в охлажденной воде в течение 30-120 мин их переносят на пред­метное стекло в каплю 4%-ного раствора нигрозина при темпера­туре 18-20 °С на 2-3 мин.

Приготовление красителя. Готовят нигрозин растворением в кипящей ди­стиллированной воде. Раствор кипятят 5-7 мин и фильтруют в темноте. Че­рез 10-14 дней краситель готов.