20

Способы подготовки к исследованию и методы изучения клетки

Рассмотрим методы исследования, при помощи которых накапливают данные о строении, функции, химическом составе клетки и ее структурных компонентов. К ним относятся: при­жизненные наблюдения, изучение фиксированных и окрашенных клеток и тканей, высушенных замороженных (лиофилизированиых) объектов, цитохимия, дифференциальное центрифугирование, авторадиография, культура клеток и тканей, микрургия и др.

Почти каждый из перечисленных методов исследования не­пременно сопряжен с одним или несколькими методами наблю­дения. Исследователь для получения информации о протекаю­щих процессах на уровне клетки должен быть хорошо знаком с разными способами исследования клетки, которые неравно­ценны между собой, и каждый имеет свои достоинства и недо­статки.

Прижизненные наблюдения объектов очень распространены в цитофизиологии. Пыльцевые зерна, пыльцевые трубки, рыльца, столбики, волоски тычиночных нитей нередко для изучения морфологии клетки, прижизненной кислотности, окислительно-восстановительного потенциала, степени дисперсности коллоидов протопласта, жизнеспособности, проницаемости и т.д. приходится смотреть под микроскопом в капле жидкости. Метод используют при просмотре искусственных культур клеток растений, грибов, бактерий. Вследствие низких показателей преломления содержимого живой клетки прижизненные наблюдения часто проводят на темном поле, в фазовом контрасте, поляризованном свете, флуоресцентным методом.

Препараты с живыми объектами недолговечны, а использо­вание при работе с ними красителей ограничено вследствие их токсичности. Такие красители, как янус зеленый, нейтральный красный, метиленовый синий и другие, применяют для окраши­вания живых объектов в слабой концентрации (от 10-4 до 10-5) и обрабатывают ими ткани всего несколько минут. Специальные красители – флуорохромы – применяют для изучения живых объектов в люминесцентном микроскопе. Для прижизненных на­блюдений используют следующие среды: воду, р-р сахаро­зы, вазелиновое, парафиновое, силиконовые (ВИЖ-94а, полисилаксан) масла и др.

В 1970 г. И.Д. Романов наблюдал движение цитоплазмы, сочетая прижизненные наблюдения с методом фазового контра­ста. Таким образом, он исследовал пыльцевые зерна пшеницы, ржи, овса от момента обособления пыльцевых зерен до образо­вания крахмала, что совпадает с периодом спермиогенеза, ис­пользуя в качестве среды 5%-ный раствор сахарозы.

Фиксация с последующим окрашиванием клеток и тка­ней – один из наиболее распространенных способов подготовки объектов к исследованию в цитологии и эмбриологии. Под дей­ствием химических фиксаторов (этиловый спирт, формалин, ук­сусная кислота и др.) в клетке прекращаются жизненные про­цессы, а ее химические компоненты осаждаются. После фикса­ции объект промывают. Дальнейшая обработка зависит от типа приготовления препарата. Можно окрасить материал сразу для изготовления временного препарата. Для получения тонких сре­зов толщиной в несколько микрометров объект обезвоживают, заключают в парафин и режут на микротоме. Срезы наклеивают на предметные стекла, освобождают от парафина и окрашивают. Красители подбирают так, чтобы повысить контрастность изо­бражения отдельных структур, а в ряде случаев и выявить их химический состав, например ДНК, РНК, белки и др. Точное со­держание химических веществ определяют на приборе – цитофотометре.

При цитохимических исследованиях приходится считаться с тем, что химические фиксаторы могут вызывать артефакты, т. е. изменения в клетках, вызванные тем или иным фактором. Чтобы избежать этого, используют метод высушива­ния замороженных объектов, в процессе которого химические компоненты клетки не осаждаются. Кусочки ткани толщиной около 0,1-1 мм и площадью 1 мм2 замораживают в изопентане, охлаждаемом жидким азотом до минус 170 °С. Замороженный объект переносят в сушильный аппарат, где при низкой темпе­ратуре (минус 30-40 °С) в вакууме из него удаляют воду. Вы­сушенный материал затем готовят для микроскопического ис­следования. В нем хорошо сохраняются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, некоторые полисахариды и другие соединения и не происходит нежелательного перераспределения вещества.

Дифференциальное центрифугирование приме­няют для изучения химического состава ядер, митохондрий и дру­гих структур. В этом случае объект измельчают с использова­нием сахарозы в специальном приборе – гомогенизаторе. Полу­ченный гомогенат путем дробного центрифугирования разде­ляют по плотности на фракции, состоящие из определенных, но изолированных клеточных структур. При сравнительно неболь­ших ускорениях на центрифуге из гомогеиата осаждают клеточ­ные ядра. При значительно больших ускорениях центрифугированием надосадочной жидкости выделяют митохондрии, а за­тем рибосомы и другие структуры.

Метод авторадиографии применяют для изучения локализации и синтеза нуклеиновых кислот в клеточных струк­турах с использованием меченых соединений и определения про­должительности митотического цикла. При работе этим методом используют изотопы, при распаде которых образуются электро­ны с малым запасом энергии.

Для регистрации α- и β-излучений необходимы специальные фотоэмульсии, при контакте которых с меченым объектом на них остаются следы электронов. Так изотоп подает сигнал о своем местонахождении, и это позволяет проследить движение, перераспределение и превращения определенных веществ клет­ки. Разработаны способы количественного анализа радиоавто­графов, что расширяет возможности метода.

Метод культуры клеток и тканей используют при подготовке к исследованию живых клеток в условиях, благо­приятных для их жизнедеятельности и размножения. Небольшие кусочки тканей, органы или отдельные клетки можно культи­вировать в стерильных условиях на питательной среде in vitro при оптимальной для них температуре. Культуру периодически переносят в свежую питательную среду для длительного сохра­нения жизнеспособности. Однослойные культуры клеток удоб­ны для прижизненных наблюдений методом фазового контраста и киносъемки. Так можно проследить весь жизненный цикл кле­ток. Из отдельных клеток можно вырастить целые растения. В последние годы интерес к этому методу возрос в связи с воз­можностью использовать его при изучении генетики соматиче­ских клеток: в биотехнологии – для выращивания зародышей на искусственной питательной среде, при клеточной инженерии, позволяющей получать парасексуальиые гибриды путем слия­ния изолированных протопластов разных видов растений и гаплоидов из клеток пыльников.

Нередко возникает необходимость вмешаться во внутренние процессы, протекающие в клетке. Это достигается при помощи тонкого метода исследования – микрургии. Она позволяет проводить трансплантацию ядер из клетки в клетку, определять прижизненную кислотность отдельных структур, измерять био­токи, температуру и т. д. Для выполнения подобных операций необходимы прибор микроманипулятор ММ-1 с микроскопом и набор стеклянных игл, пипеток, петель, электродов и т. д.

В цитологии микрургические операции проводят обычно на клеточном уровне, в эмбриологии – на зародышах или их орга­нах. Для микрургии объект заключают в стеклянную камеру, заполненную определенной средой, и все операции выполняют под микроскопом.

В зависимости от цели и объекта исследования можно ис­пользовать один или несколько указанных выше методов. Так, в кариологии чаще работают методом фиксации с последую­щим окрашиванием тканей и клеток. Цитофизиологи предпочи­тают прижизненные наблюдения, а в цитохимии сочетают фик­сацию, лиофилизацию, авторадиографию, прижизненные наблю­дения, окрашивание и др.

Совокупность приемов, направленных на выявление локали­зации определенных веществ в тканях и клетках, получила на­звание микроскопической гистохимии. В последние годы для изучения химии клеточных структур все чаще исполь­зуют абсорбционные оптические методы, которые>в совокупности называют цитофотометрией. Она делится на ультрафиолетовую и видимую. Последняя базируется на применении специфич­ных красителей.

Для фотометрирования используют микрофотометрические насадки (ФМЭЛ-1, ФМЭП-1), цитофотометры (МЦФВ-1, МЦФУ-1), универсальные микроскопы-фотометры, микроспек-трофотометры. Цитофотометр состоит из микроскопа и микропроектора. Анализ препарата ведут в монохроматическом свете с длиной волны, лежащей в пределах поглощения исследуемого вещества. Методы цитофотометрии позволяют измерить содер­жание поглощающих веществ в клетке и ее структурах.