Промывание и обезвоживание

Промывание. При использовании наиболее распространен­ных фиксаторов (Кариуа, Навашина) материал через определен­ное время промывают, чтобы полностью удалить остатки фикса­тора. После водных фиксаторов его промывают в проточной воде 1-3 ч, иногда дольше. Для этого объект вместе с этикеткой переносят из пробирок в марлевые мешочки, которые перевязы­вают суровыми нитками, и помещают в высокий стеклянный или фарфоровый стакан с воронкой, наполненный водой. Все это ставят под кран с проточной водой. Описанный способ промывки довольно прост и легко выполним, если в лаборатории нет спе­циальных приборов. В летнее время материал промывают 1-2 ч, в зимнее – 2-3 ч. Более 3-4 ч промывать не рекомендуется, так как хромосомы после этого хуже окрашиваются, а края их оказываются как бы разъеденными.

Обезвоживание. Промыв материал в воде, его частич­но обезвоживают в этиловом спирте. Чтобы избежать сморщи­вания тканей, обезвоживание ведут постепенно, используя серии растворов спирта возрастающей концентрации. Марлевые ме­шочки вынимают по одному из стакана с водор и развязывают» Корни или бутоны вместе с этикеткой осторожно, но быстро, чтобы материал не подсох, переносят в пробирки с 20%-м раст­вором спирта, который затем заменяют 40, 60 и 80%-ми его растворами. В каждой из пробирок материал находится по 30 мин. В 80%-м растворе спирта его можно хранить длитель­ное время. Для этого пробирки с корковыми пробками опуска­ют концами в расплавленный парафин, чтобы спирт не улетучи­вался во время хранения.

После спиртовых фиксаторов, таких, как фиксатор Карнуа, материал промывают трижды по 1-2 ч в 80%-м растворе спир­та, до полного исчезновения запаха уксусной кислоты. Для этого заранее готовят три склянки со спиртом одной концен­трации и на них наклеивают этикетки: 80%-й спирт 1, 80%-й спирт 2 и 80%-й спирт 3. Из пробирок через марлю сливают фиксатор и тотчас же, не допуская подсыхания материала, на­ливают в них 80%-й раствор спирта 1, который через 1-2 ч за­меняют раствором 2, а еще позднее - раствором 3. Промытый материал оставляют на хранение в 80%-м растворе спирта. Фик­сированный материал можно хранить и в 70%-м растворе спирта.

Чтобы ускорить обезвоживание, можно промывать объект в 96%-м растворе спирта. Это делают после таких фиксаторов, как ледяная уксусная кислота, уксусный алкоголь.

Для окончательного удаления остатков воды из фиксиро­ванного материала, находящегося в 80%-м растворе спирта, его помещают еще в четыре его раствора: два из них имеют концен­трацию 96% и два - по 100%. В каждом из них объект выдер­живают около 1 ч. Более длительное пребывание фиксирован­ного материала в 100%-м спирте придает ему хрупкость, что нежелательно.

Следует заметить, что спирт не только обезвоживает, но и несколько уплотняет ткани. И то, и другое необходимо для по­следующей заливки материала в парафин.

Пропитывание промежуточной жидкостью и парафином

Для получения тонких микротомных срезов толщиной в не­сколько микрометров материал необходимо залить в парафин, который представляет собой смесь углеводородов (реже исполь­зуют целлоидин или желатин). Температура плавления его мо­жет быть различной. Для цитоэмбриологических исследований лучше брать парафин с температурой плавления 52-54 °С. Он не смешивается со спиртом и водой, но хорошо растворяется и хлороформе, ксилоле, бензоле, толуоле. Промышленность выпу­скает гомогенизированный парафин в виде полупрозрачных бе­лых плиток без примесей и пузырьков воздуха. Имея набор па­рафинов с различной температурой плавления, можно составить из них нужное вещество.

Гомогенизированный парафин перед употреблением расплав­ляют и выдерживают в таком состоянии в термостате один или несколько дней для того, чтобы улетучились нежелательные при­меси. К тугоплавкому парафину прибавляют 5% пчелиного воска. Для хрупких объектов к парафину с температурой плав­ления 54-60 °С, кроме воска, добавляют 5% стеарина. От меха­нических примесей парафин освобождают фильтрованием в тер­мостате на обычном фильтре. Так можно очищать все обрезки парафина, образовавшиеся во время работы.

Температуру плавления парафина легко определить следую­щим образом. Берут стеклянный капилляр, термометр и стакан с водой. Капилляр заполняют расплавленным парафином и пос­ле застывания парафина привязывают к термометру, помещают в стакан с водой, которую при этом медленно подогревают. От­мечают температуру в тот момент, когда парафин расплавится.

Успешно заключить объект в парафин удается только в том случае, если было проведено тщательное обезвоживание фик­сированного материала в 96%-м растворе и 100%-м этиловом спирте. Однако и в этом случае его не сразу помещают в пара­фин, поскольку спирт с парафином не смешивается. Обычно пос­ле абсолютного спирта материал переносят в так называемую промежуточную жидкость - растворитель парафина, который позднее заменяют чистым парафином (табл. 1).