Фиксаторы, их состав и использование

Фиксация материала, т. е. быстрое умерщвление клеток в спе­циально подобранных растворах ядовитых реактивов, которые называются фиксаторами, прерывает тот или иной процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние.

Известно много фиксаторов, но каждый из них имеет опре­деленное назначение. Очень важно выбрать такой фиксатор, который, убивая клетку, несильно искажает ее прижизненную структуру и отвечает целям исследования. Для цитологических и эмбриологических исследований обычно используют ядерные фиксаторы (фиксатор С. Г. Навашина, Карнуа и др.), хорошо фиксирующие ядро. Некоторые реактивы хорошо фиксируют митохондрии и пластиды (фиксатор Г. А. Левитского) и др.

Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких ре­активов, каждый из которых редко используется для фиксации вследствие одностороннего действия. В состав этих смесей мо­гут входить: ледяная уксусная кислота, хромовая кислота, фор­малин, хлороформ, осмиевая кислота, спирт и др.

Уксусная кислота (СН3-СООН) - бесцветная жид­кость с резким запахом. Хорошо смешивается с водой, спиртом, эфиром, хлороформом. Ледяная уксусная кислота имеет 99,8% основного вещества и при охлаждении образует кристалличе­скую массу. Эта кислота, быстро проникая в ткани, может вы­звать их набухание, хорошо осаждает нуклеиновые кислоты. Кроме того, она хорошо сохраняет форму хромосом, но разру­шает митохондрии и комплекс Гольджи. Уксусная кислота вхо­дит в состав многих ядерных фиксаторов, но может использо­ваться и самостоятельно. В последние годы ее нередко заменяют при фиксации пропионовой кислотой (СНз-СН2-СООН), которая способствует лучшей фиксации и окрашива­нию объектов.

Хромовую кислоту готовят растворением в воде хро­мового ангидрида СгОз - сильного окислителя, представляюще­го собой темноокрашенные кристаллы, очень гигроскопичные и легкорастворимые в воде. Она проникает в объекты не очень быстро, коагулирует белки, сохраняет детали строения ядра, цитоплазмы, а также митохондрии и комплекс Гольджи. После фиксации хромовой кислотой объект необходимо тщательно про­мыть водой, иначе образуется осадок, мешающий окрашиванию тканей.

Осмиевая кислота представляет собой раствор сильно­го окислителя - тетраоксида осмия (OsO4). Эта кислота медлен­но, а иногда и неравномерно проникает в объект. Однако она вызывает наименьшие изменения в структуре цитоплазмы и ядра. Ею можно фиксировать митохондрии, а из органических соеди­нений - липоиды и жиры.

Формалин - водный раствор формальдегида (СН2О), при­мерно 40%-й. Это вещество может образовывать осадки в тка­нях, так как содержит в виде примеси муравьиную кислоту. Чтобы избежать их появления, необходимо пользоваться ней­тральным формалином. Для этого на дно темной бутылки с его концентрированным раствором насыпают мел. Иногда нераз-веденный формалин образует белый осадок, для растворения которого бутыль ставят в термостат при температуре 54-56 °С на сутки.

Формалин используют как составную часть ядерных фикса­торов. Он сохраняет тонкую структуру цитоплазмы, митохонд­рий и комплекса Гольджи, фиксирует липоиды, жиры и жирные кислоты, придавая некоторую твердость тканям. После фикса­ции необходима тщательная промывка в воде. Подмечено, что после фиксации объектов формалином и хромовой кислотой они плохо окрашиваются кармином.

В качестве составных частей фиксаторов нередко исполь­зуют различные растворители: ацетон (СН3-СОСН3), диоксан (С4Н8О2), хлороформ (СНСl3), петролейный эфир и спир­ты - этиловый, или этанол, - С2Н5ОН, изопропиловый, или пропанол-2,-СН3-СН(ОН)-СН3 и др. Из них наиболее часто упо­требляют этиловый спирт. Он осаждает нуклеиновые кислоты, альбумины, глобулины, но растворяет липоиды. Благодаря ней­тральной реакции применим для гистохимических исследований. Один этанол редко используют как фиксатор, так как он вызы­вает искажение структур клетки, сильное сморщивание и за­твердение тканей.

Все растворы фиксаторов готовят или на спирту (спиртовые фиксаторы), или на дистиллированной воде (водные фиксаторы). Спиртовые фиксаторы быстро проникают в ткани, и материал в них выдерживают от 30 мин до 12 ч. Водные фиксаторы зна­чительно медленнее проникают в ткани, поэтому в них объекты должны находиться не менее суток, а иногда дольше. Спирто­вые фиксаторы грубее по своему действию, чем водные, но они и более стойкие, их можно готовить заранее в отличие от водных.

Фиксатор выбирают в зависимости от цели и объекта иссле­дования. На первых этапах работы можно испытать несколько видов, чтобы выбрать наиболее надежный. Мелкие бутоны и нежные корни хорошо фиксируются в водных фиксаторах, крупные бутоны и толстые корни — в спиртовых. Трудносмачиваемые объекты (пыльники, почки и др.) для успешной фикса­ции можно обработать сначала спиртовым препаратом (несколь­ко минут), а затем водным. Хлорофилл, сахара, жиры при фик­сации обычно извлекаются из клеток, митохондрии — разруша­ются, поэтому не обнаруживаются при изучении объектов под микроскопом. Ниже приведен состав некоторых ядерных фикса­торов.

Фиксатор С.Г. Навашииа (10:4: 1) используют для фиксации корней (не слишком плотных и толстых) и мелких эмбриологических объектов. Продолжительность фиксации 24 ч в темноте.

Состав: хромовая кислота 1%-й раствор - 10 ч.; формалин - 16%-й - 4 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.

Фиксатор готовят перед употреблением, так как он быстро портится. Этот фиксатор относится к группе водных, он дейст­вует очень мягко и хорошо сохраняет структуру хромосом1.

Фиксатор Карнуа (6:3:1) широко используют в цито­логической и эмбриологической практике для изготовления постоянных микротомных и давленых препаратов. Продолжитель­ность фиксации от 2 до 12 ч.

Состав: абсолютный этиловый спирт или его 96%-й раствор - 6 ч.; хлороформ - 3 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.

Относится к группе спиртовых, быстро проникает почти в любые объекты, действует не так мягко, как фиксатор Навашина.

«Уксусный алкоголь», или фиксатор Кларка (3 : 1), широко применяют в цитологических и эмбриологических исследованиях, особенно для изготовления давленых препаратов. Материал выдерживают в фиксаторе от 2 до 12 ч, а иногда и хранят в нем при 0-3°С.

Состав: абсолютный этиловый спирт или его 96%-й раствор - 3 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.

Действует подобно фиксатору Карнуа. Уксусную кислоту иногда заменяют пропионовой. На основе последней разработай состав нескольких фиксаторов для растительных объектов:

• пропионовая кислота - 1 ч., 96%-й раствор этилового спир­та - 3 ч.;

• пропионовая кислота - 100 мл, 96%-й раствор этилового спирта - 100 мл, гидроксид железа - 0,4 г (перед тем как по­местить объект в этот фиксатор, на каждые 10 мл смеси добав­ляют несколько капель кармина);

• пропионовая кислота - 1 ч., хлороформ - 4 ч., абсолютный этиловый спирт - 3 ч.;

• формалин - 1 ч., 96%-й раствор этилового спирта - 15 ч., пропионовая кислота - 2 ч. (рассчитан на 1-2 ч действия и применяется для растительных и животных объектов).

Фиксатор Флемминга используют для мелких объ­ектов.

Состав: хромовая кислота, 1%-й раствор - 25 мл; осмиевая кислота, 2%-й - 5 мл; ледяная уксусная кислота - 10 мл; вода - 60 мл.

Материал фиксируют не менее суток, а затем промывают в воде.

Фиксатор Шампи. Продолжительность фиксации 24 ч.

Состав: хромовая кислота, 1%-й раствор - 35 мл; бихромат калия, 3%-й - 35 мл; осмиевая кислота, 2%~й-15 мл; ледяная уксусная кислота – 2-4 капли.

Фиксатор Я.С. Модилевского (9:2:2:2) исполь­зуют в эмбриологической практике. Продолжительность фикса­ции 24 н.'

Состав: хромовая кислота, 1%-й раствор - 9 ч.; формалин» 16%-й - 2 ч„; бихромат калия, 5%-й раствор - 2 ч.; уксусная кислота, 5% -й раствор - 2 ч.

Фиксатор водный, мягкого действия.

Фиксатор Чемберлена (почти универсальный) приме­няют для эмбриологических и анатомических исследований* особенно крупных объектов. Продолжительность фиксации 16 ч. В этом фиксаторе материал можно хранить.

Состав: этиловый спирт, 50-70%-й раствор - 90 ч.; форма­лин - 5 ч.; ледяная уксусная кислота - 5 ч. По действию зани­мает промежуточное положение между фиксаторами Карнуа и Навашина.

Фиксатор Батталья используют в цитологической практике в двух соотношениях 1 - 5:1:1:1 и 2 - 5:5:1:1 (во втором объекты можно хранить). Продолжительность обра­ботки 5 мин.

Состав фиксатора 1 этиловый спирт, 96%-й раствор - 5 ч.; хлороформ - 1 ч.; формалин, 16%-й - 1 ч.; ледяная уксусная кислота - 1 ч.

Состав фиксатора 2: этиловый спирт, 96%-й раствор - 5 ч.; хлороформ - 5 ч.; формалин, 16%-й - 1 ч.; ледяная уксусная кислота - 1ч.

Фиксатор Ньюкомера (6:3:1:1:1) в последние го­ды применяют для изучения мейоза у зерновых культур на дав­леных препаратах. Молодые колосья фиксируют в течение суток при комнатной температуре, затем заливают свежим фиксатором и хранят в холодильнике до анализа. Пыльники окрашивают ацетокармином. Фиксатор используют и для изучения корней.

Состав: изопропиловый спирт - 6 ч.; пропионовая кислота - 3 ч.; диоксан - 1 ч.; петролейиый эфир - 1 ч.; ацетон - 1 ч.

Ледяная уксусная кислота. Продолжительность об­работки 12-72 ч в условиях холодильника. После фиксации промывают 96%-ным раствором этилового спирта.

Фиксатор В. Я. Бродского, или ФСУ (3:1: 0,3). Ис­пользуют для цитохимических исследований, в нем хорошо со­храняется РНК.

Состав: формалин - 3 ч.; абсолютный спирт этиловый - 1 ч, уксусная кислота - 0,3 ч.

Продолжительность обработки корней 1-1,5 ч, максимум - 6 ч. После фиксации материал необходимо промыть водой в те­чение 12 ч или в трех-четырех сменах 70%-го раствора этило­вого спирта.

Фиксатор Н. Т. Кахидзе: 100 мл 75%-го раствора эти­лового спирта + 5 г сахарозы. Используется для изучения рИ ИЭТ (изоэлектрическая точка).

Фиксатор Г. А. Левитского используют при изучении митохондрий. Он состоит из трех растворов, в которые последо­вательно помещают материал.

1-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор - 3 мл; форма­лин, 4%-й - 17 мл. Продолжительность фиксации - двое суток.

2-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор - 15 мл; осмие­вая кислота, 2%-й - 2 мл; вода - 18 мл. Продолжительность фиксации - 6 сут.

3-й раствор. Хромовая кислота, 1%-й раствор - 15 мл; осмие­вая кислота, 2%-й - 4 мл. Продолжительность фиксации - 9 сут, затем материал промывают в течение суток в воде.

Фиксатор Рего также применяют для наблюдения хро­мосом.

Состав: диохромат калия, 3%-й раствор - 80 мл; форма­лин - 20 мл.

Зафиксированный материал выдерживают в темноте четве­ро суток, заменяя ежедневно фиксатор свежим. Затем на 8-13 сут материал переносят в 3%-ный раствор дихромата калия, после чего в течение суток промывают в воде.

Смесь по Немецу используют для фиксации плазмодесм.

Состав: пикриновая кислота (насыщенный раствор готовят на холоде) - 100 мл; ледяная уксусная кислота - 70,5 мл; кон­центрированная серная кислота - 0,5 мл.

Материал фиксируют 24 ч, а затем промывают 60%-м рас­твором этилового спирта. Окрашивают железным гематокси­лином.

Формалиновый спирт также применяют для фикса­ции плазмодесм.

Состав: спирт этиловый, 70%-й - 50 ч.; формалин - 10 ч. Че­рез сутки после фиксации материал промывают 70%-м раство­ром этилового спирта и хранят в 96%-м его растворе.

Смесь Гаммалунда обладает хорошими консервирую­щими свойствами для хлоропластов.

Состав: медный купорос (концентрированный раствор) - 15 ч.; формалин - 1 ч.; вода - 5 ч. Материал выдерживают в растворе 1-2 недели, затем переносят в слабый раствор фор­малина (на 1 л воды 50 мл формалина).