16.Острый миелолейкоз. Методы цитохимического анализа миелобластов.

 Злокачественное  заболевание крови, характеризующиеся бесконтрольным  ростом незрелых клеток крови (миелобластов).

М1 — острый миелобластный лейкоз без созревания. Бласты без зернистости или с единичными азурофильными гранулами, могут содержать тельца Ауэра; нуклеолы единичные. Бласты должны составлять 90%

■ М2 — острый миелобластный лейкоз с созреванием. Бласты морфологически и цитохимически не отличаются от М1, составляют от 30 до 89% неэритропоэтических клеток. Палочки Ауэра, как правило, единичные, обычные. Миелоциты, метамиелоциты и гранулоциты могут быть выявлены в вариабельном количестве (более 10%) и часто имеют ненормальную морфологию. Моноцитарные клетки составляют менее 20% неэритропоэтических клеток.

■ М3 — острый промиелоцитарный лейкоз. Большая часть клеток соответствует неопластическим промиелоцитам. Клетки часто разрушены,так что можно выявить свободно расположенные гранулы и палочки Ауэра. Ядра бластов расположены эксцентрично, варьируют в форме и размере, часто состоят из двух долей.

■ М4 — острый миеломонобластный лейкоз. Общее количество бластов в костном мозге составляет более 30%, при этом более 20% бластов костного мозга и/или более 5.109/л клеток периферической крови — монобласты, промоноциты или моноциты. Диагноз М4 ставят в том случае, когда изменения в костном мозге соответствуют М2, но в периферической крови обнаруживают более 5,0.109/л моноцитарных клеток. Промоноциты и моноциты отличаются отчётливой диффузной реакцией на наличие α-нафтилацетатэстеразы, ингибируемой NaF. Ха-

рактерный признак М4 — увеличение концентрации лизоцима в крови и моче более чем в 3 раза.

■ М5 — острый монобластный лейкоз. Бласты составляют более 30% миелокариоцитов. В костном мозге 80% и более неэритроидных клеток составляют монобласты, промоноциты и моноциты. М5 по типу бластов разделяют на две формы: М5а — монобласты составляют 80% или

более всех бластов; М5б — монобласты составляют менее 80%, а ос-

тальные — промоноциты и моноциты, причём последние составляют в

среднем 20% бластов.

■ М6 — острый эритромиелоз. В красном костном мозге эритрокариоци-

ты составляют более 50% всех клеток, характеризуются дольчатостью и

фрагментацией ядра, многоядерностью, гигантскими формами. Бласты

составляют более 30% неэритроидных клеток и могут относиться к лю-

бому из ФАБ-вариантов бластов, кроме М3. Такие эритробласты часто

выходят в периферическую кровь. Для эритрокариоцитов характерна

диффузно-гранулярная реакция на α-нафтилацетатэстеразу.

■ М7 — острый мегакариобластный лейкоз (введён в ФАБ-классификацию

в 1985 г.). Свыше 30% клеток составляют незрелые, очень полиморф-

ные бласты. Часто сильно базофильная цитоплазма бластов образует

псевдоподии. Рутинная цитохимия не показательна. Часто выявляют

миелофиброз.

• Для миелобластного лейкоза  характерны положительные реакции на липиды и на специфический фермент (пероксидазу). Реакция на гликоген отрицательна.

Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме в виде гранул золотисто-желтого цвета при использовании в реакции ортотолидина или в виде гранул темно-синего цвета при использовании бензидина. Количество гранул различно от случая к случаю - от небольшого их числа в одном участке цитоплазмы до полного ее заполнения. Реакция на МП, как и реакция на липиды, часто лучше выявляет палочки Ауэра, чем обычная паноптическая окраска. 

Вторая маркерная реакция для ОМЛ с созреванием и без созревания - реакция на липиды с Суданом черным Б. По мнению некоторых исследователей и согласно нашим наблюдениям, она даже более надежна, чем миелопероксидаза (Ковалева Л. Г., 1990). Фос-фолипиды выявляются в 14-100% бластов в виде черных гранул, которые часто заполняют всю цитоплазму клетки. 

17.Методология и клиническое значение иммунофенотипирования клеток. Классификация лимфом. Значение лабораторных методов диагностики. Иммунофенотипирование клеток - это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Иммунофенотипирование - метод, основанный на реакции антител с антигенами и используемый для определения специфических типов клеток в образцах крови, костного мозга, лимфатических узлов или других тканей. К антителам, которые реагируют со специфическими антигенами клеток, присоединена особая флюоресцентная метка. Эту метку можно обнаружить с помощью специальных приборов – проточных цитометров или люминесцентных микроскопов. Иммунофенотипирование с использованием метода проточной цитометрии имеет преимущества перед использованием других методов за счет большей точности, скорости, возможности одновременной регистрации нескольких антигенов на одной клетке. В настоящее время иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга является "золотым стандартом" в диагностике иммунодефицитов, лимфопролиферативных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Как известно, лейкоциты экспрессируют особые у каждой субпопуляции поверхностные молекулы, которые могут служить маркерами (метками). Разработана систематизированная номенклатура маркерных молекул; в ней группы моноклональных антител, каждая их которых специфически связывается с определенной маркерной молекулой, обозначены символом CD (Claster Designation). Поскольку набор антигенов клеточной поверхности лимфоцитов зависит не только от типа и стадии дифференцировки, но и от их функционального состояния, с помощью моноклональных антител можно не только различать разные субпопуляции клеток, но и отличать покоящиеся клетки от активированных.

Лимфомой называют группу раковых заболеваний, развивающихся в лимфатической системе. Различают два основных типа лимфом - л-мы Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские л-мы (НХЛ).

Гистологическая классификация лимфомы Ходжкина

Диагноз лимфомы Ходжкина может быть установлен только на основании гистологического исследования, после биопсии лимфатического органа или узла. Доказательством наличия лимфомы Ходжкина является обнаружение клеток Березовского-Рид-Штернберга.

В соответствии с Международной морфологической классификацией (Raje Classification) различают 4 классических варианта лимфомы Ходжкина:

1) нодулярный склероз (типы 1 и 2);

2) классический вариант, богатый лимфоцитами;

3) смешанно-клеточный вариант;

4) вариант лимфоидного истощения.

Рабочая классификация для клинического использования (Working Formulation, 1994)

I. Лимфомы низкой степени злокачественности

1. Из мелких лимфоцитов.

2. Фолликулярная, преимущественно из мелких клеток с расщеплёнными ядрами (I степень цитологической зрелости).

3. Фолликулярная смешанная, из мелких клеток с расщеплёнными ядрами и крупных клеток (II степень цитологической зрелости).

II. Лимфомы промежуточной степени злокачественности

1. Фолликулярная, преимущественно из крупных клеток (III степень цитологической зрелости).

2. Диффузная, из мелких клеток с расщеплёнными ядрами.

3. Диффузная, из мелких и крупных клеток.

4. Диффузная крупноклеточная.

III. Лимфомы высокой степени злокачественности

1. Диффузная иммунобластная крупноклеточная.

2. Лимфобластная.

3. Из мелких клеток с нерасщеплёнными ядрами (типа Беркитта и не-Беркитта).

Группа лимфом, не укладывающихся в эти три категории: смешанные формы; грибовидный микоз; гистиоцитарная; экстрамедуллярная плазмоцитома; неклассифицируемые формы.

Лабораторные исследования в диагностике лимфом

Анализ крови

• Анализ крови дает данные о качественном и количественном составе крови. В крови есть эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Нарушение состава крови может быть первым признаком лимфомы. Биохимический анализ крови позволяет сказать вовлечена ли печень, почки, другие органы. Некоторые показатели, определяемые в крови, влияют на выбор лечения и предсказывают прогноз. Например, у пациентов с лимфомами уровень лактатдегидрогеназы и бета-2-микроглобулина очень важны, потому что высокий уровень этих маркеров ассоциируется с более агрессивным течением лимфомы.

Иммунофенотипирование

• Клетки лимфомы, циркулирующие в крови или находящиеся в лимфоузлах, классифицируют по маркерам, находящимся на поверхности или внутри клеток. Этот метод называется иммунофенотипирование. Он так же выполняется на образцах тканей полученных во время биопсии. Результаты иммунофенотипирования имеют ключевое значение в диагностике лимфом.

Исследование костного мозга

• Лимфомы могут не только возникать в костном мозге, но и давать метастазы в костный мозг. Исследование костного мозга позволяет увидеть, есть в нем поражение или нет. Процедура получения костного мозга называется трепанобиопсия. Это малая хирургическая операция. Образец костного мозга берется через толстую иглу из кости таза, обычно в области поясницы. Процедура выполняется без госпитализации и занимает несколько минут.

• Трепанобиопсия входит в перечень обязательных исследований, необходимых для определения стадии болезни и выполняется в большинстве случаев. Нередко требуется двусторонняя трепанобиопсия, когда все то же самое делается с другой стороны.

Исследование спинномозговой жидкости

• У некоторых пациентов лимфома может распространяться в нервную систему. Если это происходит, то жидкость, которая циркулирует в спинном мозге и головном мозге (спинномозговая жидкость) может содержать аномальные опухолевые клетки. Для диагностики выполняется спинномозговая пункция. Во время пункции делается прокол в поясничной области между отростками двух позвонков. Небольшое количество жидкости насасывается в шприц. Исследуются клетки, содержащиеся в спинномозговой жидкости, а также ее биохимический состав.

Молекулярно диагностические тесты

• За последние десятилетие стало известно гораздо больше о механизмах развития лимфом на уровне молекул, таких как гены и белки. Сведения, полученные в многочисленных экспериментах, сделали возможной разработку молекулярных методов диагностики. К таким методам относится высокочувствительная полимеразная цепная реакция, а также иммунологические методы, которые выявляют экспрессию специфических белков в опухолевых клетках. Эти тесты позволяют точно определять вариант лимфомы, следить за минимальной остаточной болезнью. Информация, получаемая с помощью этих методов, позволяет докторам подобрать оптимальное лечение каждому пациенту. С помощью иммунологических и молекулярных методов, можно найти опухоль, даже в тех случаях, когда гистолог не видит ее под микроскопом. Важным преимуществом молекулярных методов является то, что они точны и требуют небольшого количества ткани.