II. Проплазмоцит и плазмоцит

В-иммунобласты дифференцируютсяв проплазмоциты (содержат отдельные цепи иммуноглобулина в цитоплазме) и далее  в плазматические клетки (плазмоциты, или плазматоциты; п. 9.2.2.2).
Фазы антитело- образования	1. Вначале последние начинают секретировать в окружающее пространство (и в кровь) IgМ. -Это первая фаза антителообразования. 2. а) Но затем, путём перестройки соответствующего гена (видимо, в предшественниках плазмоцитов) происходит т.н. СН-переключение -смена класса синтезируемых иммуноглобулинов(при сохранении их прежней иммуноспецифичности). б) Чаще всего начинают образовываться иммуноглобулины класса G (IgG); они-то и составляют основной класс Ig в крови. -Это вторая фаза антителообразования.
Морфоло- гия плазмоцитов	1. Сами плазматические клетки имеюткрупные размеры, а такжеочень хорошо развитые шероховатый эндоплазматический ретикулум (1) и комплекс Гольджи (2). 2. Плазмоциты делятся редко и живут 2-3 недели.

III. Активированные т-лимфоциты

1. а) Т-иммунобласты (в отличие от В-иммунобластов) в процессе дифференцировки превращаются в обычные Т-лимфоциты трёх популяций - ТК , ТХ , ТС. б) Но число последних уже много больше, чем до стимуляции, что обеспечивает гораздо более высокую эффективность иммунной реакции. 2. Кроме того, может образовываться ещё одна популяция киллеров - ТГЗТ, т.е. клетки, вызывающиегиперчувствительность замедленного типа -местную воспалительную реакцию, которая иногда развивается при повторном введении антигена.

IV. В- и Т-клетки памяти

1. а) Часть потомков иммунобластов (и В-, и Т-типа) превращается в т.н. клетки памяти. б) Как и активированные Т-клетки, они имеют вид малых лимфоцитов. 2. а) Этих клеток больше, чем было до стимуляции; и, кроме того, в них, возможно, увеличено число генов, кодирующих пептидные цепи соответствующего иммуноглобулина. б) Поэтому вторичная иммунная реакция (при повторном антигенном раздражении) развивается быстрей и интенсивней.

Т-лимфоциты окончательно созревают в тимусе. Зрелые Т- и В-лимфоциты расселяются соответственно по Т- и В-зависимым зонам лимфатических органов, периодически рециркулируют в крови и лимфе. Встретившись с антигеном, при взаимодействии с макрофагами и Т-хелперами, лимфоциты претерпевают процесс бласттрансформации, превращаются в иммунобласты, многократно делятся, созревают и превращаются в клетки-эффекторы иммунного ответа (Т-лимфоциты, которые осуществляют клеточный иммунитет, и плазматические клетки, обеспечивающие гуморальный иммунитет), а также клетки памяти. Продолжительность жизни В-лимфоцитов измеряется неделями, Т-лимфоцитов -месяцами, а клеток памяти - годами и десятками лет. 11.Красный кровяной росток, этапы созревания, функционирование эритропоэтического ростка К морфологически идентифицируемым эритроидным клеткам относятся: эритробласт → пронормобласт → нормобласт базофильный → нормобласт полихроматофильный → нормобласт оксифильный → ретикулоцит → эритроцит.

Отличительная черта эритроидных клеток – постепенное уменьшение размеров по мере созревания.

Эритробласт. Клетка диаметром 20-25 мкм с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Ядро круглое с нежно-сетчатой структурой хроматина и 1-3 ядрышками, окруженное узким ободком резко базофильной (темно-синей) цитоплазмы.

Пронормобласт отличается от эритробласта меньшими размерами, отсутствием ядрышек в ядре и наличиемперинуклеарной(околоядерной) зоны просветления.

Нормобласт базофильный. Клетка диаметром 16-18 мкм с центрально размещенным крупным округлым ядром насыщенно фиолетового цвета. Ядрышек нет. Хроматин имеет тенденцию к радиальному расположению. Цитоплазма окружает ядро узким ободком синего цвета.

Нормобласт полихроматофильный. Размер клеток 8-12 мкм. Ядро темно-фиолетового цвета, размещается центрально или эксцентрично, имеет колесовидную структур хроматина (в виде «спиц в колесе»). Цитоплазма широкая, серовато-голубая.

Нормобласт оксифильный. Диаметр 8-11 мкм. Ядро пикнотичное, темно-фиолетового цвета, размещается эксцентрично (имеет вид «вишневой косточки»). Цитоплзма широкая, бледно-розовая.

Ретикулоцит – молодой эритроцит с зернисто-сетчатой субстанцией, выявляемой при суправитальной окраске. Она представляет собой остатки органелл – митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом и др. Определяется в виде клубков, зерен и пылинок. По мере созревания ретикулоцитов их количество уменьшается. По количеству ретикулоцитов судят о функциональном состоянии КМ:увеличение (ретикулоцитоз)– свидетельствует об усилении регенераторной функции КМ – имеет место при постгеморрагических и гемолитических анемиях;снижение (ретикулоцитопения)– об угнетении эритропоэза – при гипо- и апластических анемиях.

Эритроцит – зрелая безъядерная клетка розового цвета - результат обезъядривания ретикулоцита или оксифильного нормобласта.

Нормальное содержание эритроцитов в периферической крови – 3,6-3,8 Т/л (*10¹²/л).

Основным событием эритропоэза является синтез гемоглобина, который начинается уже на стадии базофильного нормобласта. Количество гемоглобина контролирует синтез ДНК: чем больше гемоглобина в цитоплазме нормобласта, тем медленнее происходит синтез ДНК, который прекращается при содержании гемоглобина 27 пг в расчете на клетку. При нормобластическом эритро-поэзе содержание гемоглобина достигает 27 пг обычно на стадии оксифильно-го нормобласта, синтез ДНК прекращается, ядро становится пикнотичным, маленьким, выталкивается из клетки, после чего клетка переходит в следующую стадию - ретикулоцит. Таким образом полихроматофильные нормобласты - последняя генерация в эритропоэтическом ростке, способная к делению.

В нормальном эритропоэзе работает и другой механизм: в небольшом проценте клеток (около 5%) нарушается синхронизм в синтезе гемоглобина и ДНК, синтез ДНК происходит медленно, в результате чего клетка подходит к митозу

с содержанием гемоглобина, равным 27 пг, что блокирует митоз. Эти клетки не способны к дальнейшему нормальному развитию, обречены на гибель или образуют мегалоциты - гигантские эритроциты с резко укороченной продолжительностью жизни. Это явление получило название неэффективного эритропоэза, физиологическое значение его до конца неясно. Однако при дефиците витамина В₁₂ и/или фолиевой кислоты удельный вес неэффективного эритропоэза резко увеличивается, красный росток становится мегалобластическим

В эритропоэзе универсальным регулятором является эритропоэтин, выделяемый почечной тканью, усиление его образования вызывается тканевой гипоксией.

Эритроциты осуществляют свои функции в циркуляции и заканчивают жизнь спустя 100-120 дней в ретикулогистиоцитарной системе преимущественно селезенки, подвергаясь фагоцитозу.

12.Цитологическое исследование костного мозга: методика, клиническое значение. Нормальная миелограмма. Клетки костномозгового окружения, морфологическая оценка и клиническое значение Исследование костного мозга.

Пункция грудины или подвздошной кости -> готовят мазок -> подсчитывают процентное содержание костномозговых элементов, определяют абсолютное содеражание миелоцитов и мегакариоцитов.

Миелограмма — процентное соотношение клеточных элементов в мазках, приготовленных из пунктатов красного костного мозга. Костный мозг содержит две группы клеток: клетки ретикулярной стромы (фибробласты, остеобласты, жировые и эндотелиальные клетки), составляющие абсолютное меньшинство по численности, и клетки кроветворной ткани (паренхимы). В настоящее время биопсия красного костного мозга — обязательный метод диагностики в гематологии, так как позволяет оценивать тканевые взаимоотношения в костном мозге. Исследование красного костного мозга проводят для подтверждения или установления диагноза различных форм гемобластозов и анемий. Миелограмму необходимо оценивать, сопоставляя её с картиной периферической крови. Диагностическое значение имеет исследование костного мозга при поражении его лимфогранулематозом, туберкулёзом, болезнью Гоше, Нимана−Пика, метастазами опухолей, висцеральным лейшманиозом. Это исследование широко используется в динамике для оценки эффективности проводимой терапии.

Референтные показатели миелограммы

Элементы красного костного мозга Количество,% Бласты 0,1−1,1 Миелобласты 0,2−1,7 Нейтрофилы Промиелоциты 1−4,1 Миелоциты 7−12,2 Метамиелоциты 8−15 Палочкоядерные 12,8−23,7 Сегментоядерные 13,1−24,1 Все нейтрофильные элементы 52,7−68,9 Индекс созревания нейтрофилов 0,5−0,9 Эозинофилы (всех генераций) 0,5−5,8 Базофилы 0,−05 Лимфоциты 4,3−13,7 Моноциты 0,7−3,1 Плазматические клетки 0,1−1,8 Эритробласты 0,2−1,1 Пронормоциты 0,1−1,2 Нормоциты: базофильные 1,4−4,6 полихроматофильные 8,9−16,9 оксифильные 0,8−5,6 Все эритроидные элементы 14,5−26,5 Ретикулярные клетки 0,1−1,6 Индекс созревания эритрокариоцитов 0,7−0,9 Лейкоэритробластическое отношение 2,1−4,5 Количество миелокариоцитов 41,6−195,0×109/л Количество мегакариоцитов 0,05−0,15×109/л или 0,2−0,4%

Клетки костномозгового окружения.

Клеточные элементы :

Макрофаги, ретикулярные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки, адвентициальные и жировые клетки, остокласты, остеобласты, остеоциты.

Неклеточные элементы:

Набор нерастворимых белков ( глизамингликаны, протеогликаны, фибронектин)

Коллагеновые и эластические волокна 13.Методология и клиническое значение цитогенетических методов исследования костного мозга

Цитогенетическое исследование — это микроскопический анализ хромосом. Хромосомы диагностируются на стадии прометофазы митоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды, и особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.

Для цитогенетического анализа лейкозов, миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний исследуют клетки костного мозга. При невозможности их получения может быть исследована кровь (если она содержит бласты). Цитогенетический анализ лимфом выполняется в клетках ткани лимфатического узла. Культивирование клеток из опухоли повышает митотический индекс (пропорцию клеток, находящихся в фазе митоза) и способствует пролиферации злокачественных клеток. Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения — фитогемагглютинином

Окрашивание хромосом в гематологии

При Q-окрашивании акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом выявляется особый тип флюоресценции каждой хромосомы с образованием Q-исчерченности (Q-banding) — поперечных флюоресцентных полос, называемых Q-полосами (Q.-bands). Это позволяет идентифицировать отдельные хромосомы. Анализ Q-полос выполняют с помощью флюоресцентного микроскопа.

При окрашивании по Гимзе (G-banding) хромосомы приобретают вид серии темных и светлых полос или бэндов (bands). G-окрашивание применяется чаще, чем Q-окрашивание, так как анализ выполняется с помощью светового микроскопа, а G-полосы, в отличие от Q-полос, не выцветают со временем. Наиболее широко применяется методика, называемая GTG-окрашиванием (G bands by trypsin using Giemsa), с предварительной обработкой трипсином. R-бэндинг (обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе) выявляет полосы, которые обратны G-полосам и называются R-полосами (reverse of G bands). Помимо Q-, G- и R-окрашивания, позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание — от англ. constitutive), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание — от англ. nucleolus organizing region). Размеры и положение С-полос уникальны для каждой хромосомы, но преимущественно они включают центромерныи район и используются при исследовании хромосомных транслокаций, вовлекающих центромерные районы хромосом.

С развитием методов рекомбинантной ДНК стало возможным использование гибридизации in situ для определения местоположения на хромосомах или в клеточном ядре любой ДНК- и РНК-последовательности. С ее помощью можно изучать и диагностировать онкологические и наследственные генетические болезни. Молекулярная гибридизация in situ является важным инструментом цитогенетических исследований, позволяет выявлять хромосомные перестройки, идентифицировать маркерные хромосомы, проводить быстрое кариотипирование клеточных линий. Важно, что подобный анализ можно проводить не только на метафазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах.

Этапы:

подготовка и мечение ДНК (РНК)-зонда, приготовление препаратов хромосом, собственно гибридизация, детекция гибридных молекул.

Метод FISH флюоресцентной гибридизацией in situ

Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).

Метод FISH предназначен для выявления: 1) гибридных клеток; 2) транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий; 3) меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.

Клиническое значение цитогенетических исследований Диагноз. Потомство клетки с приобретенной цитогенетической аномалией может иметь пролиферативное преимущество и давать начало клону — клеточной популяции, происходящей от одной клетки-предшественницы. Обнаружение клональных хромосомных аномалий способствует постановке диагноза клонального поражения костного мозга. Например, цитогенетический анализ позволяет установить диагноз миелодиспластического синдрома у пациентов с умеренной цитопенией или при наличии в аспирате костного мозга минимально выраженных качественных нарушений гемопоэза. Присутствие специфических хромосомных аномалий помогает выделить подгруппы пациентов, которым требуется специфическая терапия. Например, транслокация t(15;17)(q22;qll-21) подтверждает диагноз острого промиелоцитарного лейкоза (ОМЛ — МЗ), в комплексном лечении которого используется ретиноевая кислота. Прогноз. Результаты цитогенетического анализа имеют не только диагностическое, но и прогностическое значение. Например, обнаружение множественных хромосомных аномалий у больных острыми лейкозами до начала лечения является прогностически неблагоприятным и служит основанием для выполнения трансплантации костного мозга или стволовых клеток периферической крови в первой полной ремиссии. Контроль результатов лечения. Цитогенетический анализ костного мозга пациентов после проведенного лечения помогает контролировать степень элиминации опухолевого клона и, следовательно, полноту ремиссии. Выявление хромосомных аномалий, характерных для опухолевых клеток данного пациента, является ранним признаком, свидетельствующим о приближающемся рецидиве. Цитогенетический анализ имеет большое значение в диагностике и лечении гематологических заболеваний, которое все возрастает по мере совершенствования методологии и накопления знаний об этиологической и патогенетической роли хромосомных аномалий в развитии этих болезней.