Алемасова - Лекции по аналитической химии

трацен и многие другие вещества. Устройство сцинтилляционного счетчика показано на рис.18.5.

Рис. 18.5. Сцинтилляционный счетчик:

1 – сцинтиллятор; 2 – фотокатод; 3 – фотоэлектронный умножи-

тель; 4, 5, 6, 8, 9, 10 – эмиттеры; 7 – анод Радиоактивное излучение возникает при самопроизвольном распаде

атомного ядра. Элементы, имеющие естественную радиоактивность, могут быть определены по этому свойству количественно. Это U, Th, Ra, Ac, K и др., всего более 20 элементов. Определение обычно проводят с помощью градуировочного графика, показывающего зависимость активности от содержания (%) определяемого элемента или методом добавок. Большое значение имеют радиометрические методы в поисковой работе геологов, например, при разведке месторождений урана.

18.3.2. Активационный анализ

При облучении нейтронами, протонами и другими частицами высокой энергии многие нерадиоактивные элементы становятся радиоактивными. Активационный анализ основан на измерении этой радиоактивности. Наибольшее практическое применение имеет процесс облучения нейтронами. Основным источником нейтронов для проведения активационного анализа является атомный реактор и портативные источники (радиевобериллиевый и др.). В последнем случае α-частицы, получившиеся при распаде какого-либо α-активного элемента (Ra, Rn и др.), взаимодействуют с

ядрами бериллия, выделяя нейтроны:

9Be + 4He → 12C + n

Нейтроны вступают в ядерную реакцию с компонентами анализируе-

мой пробы, например

55Mn + n = 56Mn или Mn (n, γ)56Mn

Радиоактивный 56Mn распадается с периодом полураспада 2,6 часа:

56Mn → 56Fe + e–

Для получения информации о составе образца некоторое время измеряют его радиоактивность и анализируют полученную кривую. При проведении такого анализа необходимо располагать надежными данными о пе-

261

риодах полураспада различных изотопов, с тем, чтобы провести расшифровку суммарной кривой.

На практике обычно используют относительный метод анализа, когда в одинаковых условиях облучают анализируемый образец и эталон с известным содержанием определяемого элемента, что существенно упрощает анализ. Во многих случаях образец после облучения переводят в раствор, производят химическое выделение интересующих компонентов методом экстракции, хроматографии, осаждением или другими методами и определяют активность продуктов разложения. Операции химического разделения значительно расширяют возможности метода, повышают селективность.

Другим вариантом активационного анализа является метод γ- спектроскопии, основанный на измерении спектра γ-излучения образца. Энергия γ-излучения является качественной, а скорость счета – количественной характеристикой изотопа. Измерения производят с помощью многоканальных γ-спектрометров со сцинтилляционными или полупроводниковыми счетчиками. Это значительно более быстрый и специфичный, хотя

инесколько менее чувствительный метод анализа, чем радиохимический.

Внастоящее время различные варианты активационного анализа получили широкое и разнообразное применение. Наибольшее значение имеет анализ веществ высокой чистоты, используемых, например, в полупроводниковой и атомной промышленности, ракетной технике и т.д. Он с успехом применяется для анализа воды и многих геохимических объектов, для определения состава биологических и космохимических материалов, мате-

риалов новой техники.

Метод отличает низкий предел обнаружения (до 10–13 – 10–15 г вещества) и даже ниже. Например, с его помощью контролируют чистоту крем-

ния и германия в промышленности полупроводников, обнаруживая содержание примесей до 10–8 – 10–9%. Такие содержания никаким другим методом, кроме активационного анализа, определить невозможно. При получении тяжелых элементов периодической системы, таких, как менделевий и курчатовий, удавалось считать почти каждый атом полученного элемента.

Основным недостатком активационного анализа является громоздкость источника нейтронов, а также нередко длительность процесса получения результатов.

Применение активационного анализа позволило решить многие геохимические и общенаучные проблемы, например, связанные с установлением возраста минералов и образцов органического происхождения. Например, хорошо известный радиометрический способ определения возраста древних предметов и изделий органического происхождения основан на том, что в атмосфере в результате ядерной реакции постоянно образуется

радиоактивный углерод 14С с периодом полураспада 5300 лет:

14N + n = 14C + p

262

Нейтроны генерируются в атмосфере при взаимодействии космического излучения с веществом, а азот является составной частью атмосферы. Радиоактивный 14С образует радиоактивный 14СО2, который вступает в биологический круговорот. Таким образом, вещества и организмы, участвующие в этом круговороте (растения, животные и т.д.), будут иметь примерно постоянную радиоактивность, пропорциональную содержанию 14С. В организмах, которые выпадают из круговорота в результате гибели, количество радиоактивного 14С не пополняется и их активность уменьшается. Следовательно, если измерить активность какого-либо древнего изделия (предмета из дерева, кожи и т.д.), то, зная период полураспада углерода 14С и общее содержание углерода в образце, можно рассчитать промежуток времени, прошедший с момента гибели организма. Этот промежуток будет характеризовать примерный возраст изделия. Анализ этим методом позволил уточнить даты многих важных событий далекой древности.

Активационный анализ используется для обнаружения взрывчатки. Как известно, в качестве взрывчатых веществ обычно используют различные нитросоединения. Способ обнаружения основан на том, что взрывчатка наряду с 14N содержит некоторое количество 15N, который при облучении нейтронами превращается в 16N. Этот изотоп имеет период полураспада 7 с и при его распаде кроме β-частиц происходит испускание γ-квантов определенной энергии. Появление β-квантов с энергией, характерной для распада 16N после облучения вещества нейтронами, является сигналом о наличии азотсодержащего вещества, возможно взрывчатки.

18.3.3. Метод изотопного разбавления

Это метод количественного химического анализа с использованием радиоактивных или обогащенных стабильных изотопов. Определение компонента основано на изменении удельной активности вследствие разбавления в ходе анализа. К анализируемому раствору добавляют известное количество w определяемого вещества, содержащего радиоактивный изотоп с активностью А и удельной активностью S1 = A/w. После достижения равновесия изотопного обмена между радиоактивными и стабильными атомами из раствора выделяют тем или иным способом (экстракцией, ионным обменом, осаждением и т.д.) часть определяемого вещества, измеряют ее массу (гравиметрическим, спектрофотометрическим, титриметрическим или другим методом), радиоактивность и устанавливают удельную активность S2 = A/(w + x), где х – исходное количество определяемого вещества. Из представленных выше уравнений для S1 и S2 можно найти х = w[(S1/S2)

– 1]. Предел обнаружения ограничен чувствительностью измерения массы выделенной доли вещества и составляет 10–2 – 10–3%.

Применение субстехиометрического выделения позволяет избежать определения массы и снизить предел обнаружения до 10–5 – 10–7%. В этом

263

варианте метода к эталонному и исследуемому растворам, содержащим одинаковое количество у радиоактивного изотопа определяемого элемента, в равных количествах добавляют реагент; при этом количество последнего должно быть меньше, чем требуется по стехиометрии для взаимодействия со всей массой определяемого вещества. Продукты реакции выделяют подходящим способом и измеряют их активности Аэт и Ах. Значение х рассчитывают по формуле: х = у[(Аэт/Ах) – 1].

Метод изотопного разбавления применяют для количественного определения элементов с близкими химическими свойствами, элементовпримесей в полупроводниковых материалах, для анализа радиоактивных веществ, а также сложных смесей органических соединений (например, аминокислот, лекарственных средств).

1.Пилипенко А.Т., Пятницкий И.В. Аналитическая химия. В 2-х книгах. – М.: Химия, 1990.

–Кн. 2.– С. 704-727, 785-794.

2.Пономарев В.Д. Аналитическая химия. В 2- х частях. – М.: Высшая школа, 1982. – Ч. 2. –

С. 205-211.

3.Основы аналитической химии. В 2-х книгах/ Под ред. Ю.А.Золотова. – М.: Высш.шк., 2004.

–Кн. 2. – С. 372-379.

4.Васильев В.П. Аналитическая химия. В 2-х книгах. – М.: Дрофа, 2002. –

Кн. 2. – С. 246-260.

Раздел 19

БИОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

19.1. Объекты исследования и отбор проб

Основными объектами исследования в клинической аналитической лаборатории являются цельная кровь, плазма, сыворотка, моча, пот, слюна, желудочный сок, кал, ткани и жидкости

Цельная кровь отбирается путем укола пальца или взятия крови из вены (или артерии). По своему составу капиллярная кровь ближе к артериальной, нежели к венозной крови. Несмотря на все предосторожности при отборе крови из пальца к капиллярной крови примешивается некоторое количество лимфы, что меняет состав исследуемой крови. Артериальную кровь у человека берут путем пункции лучевой или бедренной артерии. У крупных животных (лошадь, корова) кровь берут из ушной или яремной вены и сонной артерии, у собак – из подкожной вены нижней конечности,

264

ушной или яремной вены. У кроликов кровь обычно берут из ушной вены с помощью иглы или надреза вены ланцетом. Цельная кровь содержит большое число клеточных компонентов, включая эритроциты (красные кровяные тельца), лейкоциты (белые кровяные тельца) и другие форменные элементы, большое количество коллоидных макромолекулярных веществ и низкомолекулярных соединений.

Если для исследования нужна сыворотка, то кровь собирают в стерильную пробирку, закрывают ватой и, наклонив пробирку, оставляют так, чтобы она по возможности сохраняла свою температуру во время свертывания. Для облегчения отделения сыворотки пробирку слегка встряхивают или постукивают по ней пальцем. Через 3 часа сыворотка обычно отделяется полностью. Ее осторожно сливают так, чтобы при этом не захватить красные кровяные шарики. От последних в случае надобности сыворотку освобождают центрифугированием.

Если исследованию подлежит плазма или эритроциты (или цельная кровь, которую анализируют не сразу после взятия), то кровь собирают в сосуд, содержащий небольшое количество вещества, предупреждающего свертывание и гемолиз: для этой цели обычно берут щавелевокислые или лимоннокислые соли, фтористый натрий, гирудин, гепарин и др., в зависимости от характера последующего определения. Обычно на 10 мл крови берут 0,01 – 0,02 г оксалата натрия или фторида натрия или 3 – 4 капли раствора гирудина.

Для исследования эритроцитов кровь центрифугируют и осадок эритроцитов отмывают физиологическим раствором. Оставшаяся плазма окрашена в желтый цвет благодаря коллоидным протеинам.

Для приготовления безбелкового фильтрата крови используют осаждение белков крови с помощью вольфрамата натрия, трихлоруксусной кислоты, фосфорномолибденовой кислоты, соли цинка(II), меди(II).

Для определения суточного количества мочи ее начинают собирать утром с определенного часа (причем первую порцию мочи отбрасывают) в чистую большую колбу, заканчивая собирание ее в тот же час на следующее утро. Объем мочи определяют в большом мерном цилиндре, куда медленно сливают все содержимое колбы, избегая образования пены.

Кислая моча хорошо сохраняется на холоду в герметически закрытых сосудах, а также после прибавления к ней на 1 л 5 мл толуола или 2,5 мл хлороформа.

В моче могут содержаться белки, кетонные тела, билирубин, уробилиноген, лейкоциты, эритроциты, а в очень малых количествах – до тысячи компонентов, в том числе ионы металлов в виде комплексов.

Удаление ткани из организма, нарушение ее связи с центральной нервной системой, нарушение кровообращения и т.д. не могут не оказывать значительного влияния на течение биохимических процессов и в ряде случаев приводят к полному искажению прижизненной картины. Предва-

265

рительный убой животного полностью искажает исследование лабильных биохимических субстратов. При наркозе нарушается нормальная нервная регуляция функций. Поэтому предложено несколько методик отбора тканей и органов животных (замораживание в жидком воздухе или кислороде и др.). Применение фиксации быстрым замораживанием является обязательным при исследовании лабильных фосфорных соединений (аденозинтрифосфата, фосфокреатина, гексозофосфорных эфиров) и молочной кислоты в головном мозгу, а также аденозинтрифосфата и молочной кислоты в мышцах. Пробы тканей, легко доступных для исследования (например, кожа, эктодермальные ткани) могут быть взяты путем биопсии.

19.2.Определение газов в цельной крови

Вцельной крови в лаборатории определяют концентрацию растворенных газов, в первую очередь, кислорода и углекислого газа. Для этих целей используют амперометрические датчики и газочувствительные ионоселективные электроды. Так, для определения концентрации кислорода используется электрод (сенсор) Кларка, представляющий собой электрохимическую ячейку, содержащую небольшой объем электролита, в который помещены платиновый электрод и электрод сравнения (рис. 19.1).

Рис. 19.1. Схема электрода для определения кислорода:

1 – внешний электролит; 2 – пористая мембрана; 3 – внутренний электролит; 4 – индикаторный электрод; 5 – токоотвод

Электролит датчика отделяют от внешнего раствора мембраной, проницаемой для кислорода. Если концентрация кислорода с внешней стороны мембраны превышает концентрацию во внутреннем растворе, то молекулы кислорода диффундируют через мембрану, растворяются в электролите и дают отклик индикаторного электрода.

Кислород электрохимически (амперометрически) восстанавливается

O2 + 4H+ + 4e → 2H2O

и наблюдаемый ток пропорционален концентрации растворенного кислорода, который можно определить по градуировочной кривой.

Применяют тонкие пористые мембраны из полиэтилена, тефлона силиконовой резины. Чем выше проницаемость мембраны, тем больший сиг-

266

нал может быть получен, благодаря чему можно определять низкие концентрации кислорода. Разработаны электроды с тонкой пленкой электролита, толщина которой регулируется за счет капиллярных сил. Такие датчики имеют высокую чувствительность (до 0,1 млн–1 О2), просты и применяются в автоматических приборах – мультианализаторах в клинических лабораториях.

Подобные газочувствительные сенсоры используют для определения и других газов. Например, концентрация СО2 определяется модифицированным рН-чувствительным стеклянным электродом, покрытым тефлоновой мембраной, проницаемой только для СО2.

Газочувствительные электроды – это датчики, объединяющие ин-

дикаторный электрод и электрод сравнения и имеющие газопроницаемую мембрану или воздушный зазор для отделения анализируемого раствора от тонкой пленки промежуточного раствора электролита. Он взаимодействует с определяемым газом, при этом изменяется какой-то параметр промежуточного раствора, например рН, что и фиксирует ионоселективный электрод. Отклик ионоселективного электрода пропорционален парциальному давлению определяемого компонента в анализируемом объекте. Схематическое изображение газочувствительного электрода приведено на рис. 19.2.

Рис. 19.2. Газоселективный электрод для определения аммиака:

1 – гидрофобная газопроницаемая мембрана; 2 – внутренний раствор электролита; 3 – анализируемый раствор; 4 – NH4+ – селективный электрод; 5 – электрод сравнения

В табл. 19.1 представлены примеры практического применения газочувствительных электродов.

267

Таблица 19.1. Применение газочувствительных электродов

19.3.Тест-методы в клинических исследованиях

Втест-методах используются упрощенные приемы и приспособления для быстрого обнаружения и полуколичественной оценки содержания химических веществ в различных объектах без отбора пробы. Тест-методы могут быть химическими, биохимическими и биологическими. Конструктивно они выполняются в виде индикаторных лент, полосок, трубок или специальных наборов растворов реагентов с вспомогательными приспособлениями для проведения реакций. Химические и биохимические тестнаборы, как правило, снабжаются стандартными цветовыми шкалами, по которым оценивают приближенное содержание определяемого компонента

вобразце.

Химические тест-методы используют реакции с окрашенными неорганическими или органическими реагентами, которые при контакте с определяемым компонентом изменяют цвет. Окрашенный реагент наносят на твердую матрицу, в качестве которой используют впитывающую целлюлозную бумагу, полимерные материалы или неорганические сорбенты. Закрепление реагентов на матрице может быть адсорбционным или ковалентным.

Адсорбционное закрепление осуществляется пропиткой матрицы раствором соответствующего реагента. Матрица может дополнительно пропитываться буферными растворами, маскирующими, эмульгирующими, закрепляющими соединениями, катализаторами, стабилизаторами. Недостатком такого способа закрепления реагента является возможность его вымывания водой и загрязнение исследуемого раствора. Поэтому подобные тесты предназначены для однократного использования.

268

Другой способ нанесения реагента заключается в его иммобилизации на матрице путем многостадийного синтеза с использованием вспомогательных реагентов. В результате реагент ковалентно связывается с материалом матрицы. Такой способ закрепления реагентов приводит к тому, что тесты можно длительно хранить и многократно применять, разрушая образующиеся продукты реакции промыванием водой или кислотой.

В биохимических тест-методах на матрице иммобилизуют различные ферменты, антигены или антитела.

Наиболее распространены тест-методы определения глюкозы в крови и в моче. Присутствие глюкозы в моче – наиболее важный химический симптом диабета. При ранней диагностике диабета или заключении об излечении больного необходимо определять очень малые содержания глюкозы в моче, причем самому потенциальному пациенту.

Химической основой практически всех используемых тестов на глюкозу в моче является специфический ферментативный катализ, окисление глюкозы кислородом воздуха либо восстановление меди(II) сахаром в горячем щелочном растворе (реакция Бенедикта). Реакция 2,2´- бицинхониновой кислоты для детектирования появления меди(I) в 104 раз чувствительнее реакции восстановления меди(II) сахаром. Реагент готовят смешением эквивалентных количеств двух растворов: раствора 2,2´- бицинхониновой кислоты в присутствии карбоната – гидрокарбоната натрия и раствора меди(II) в присутствии L-серина. Первым биохимическим тестом на глюкозу в моче был тест на основе глюкозоксидазы и пероксидазы с субстратом о-толидином. В качестве хромогенных реагентов предложены тартразин, 4-аминоантипирин, 3,5-дихлор-2- оксибензолсульфокислота, тетраметил-бензидин. Селективность определения глюкозы зависит не столько от хромогенного реагента, изменяющего окраску в ее присутствии, сколько от селективности фермента на глюкозу. Например, при окислении D-глюкозы кислородом воздуха в присутствии глюкозоксидазы (селективный фермент на глюкозу) образуется β-D- глюконолактон и пероксид водорода. Последний в присутствии пероксидазы, входящей в набор тест-реагентов, окисляет хромогенный реагент (а не исходная глюкоза, индифферентная к хромогенному реагенту). Продукт окисления окрашен в характерный цвет, по интенсивности которого оценивают содержание глюкозы. Обычно для анализа достаточно одной капли крови. В то же время тестирование предполагает устранение влияния плазмы и отделение сыворотки с помощью специально подготовленных тест-полосок или простейших аппаратов.

Возрастающие потребности в быстрых, недорогих и надежных методах определения глюкозы в физиологических жидкостях, главным образом в крови, стимулировали разработку новых тест-методов на глюкозу. Хорошая тест-система для определения глюкозы должна удовлетворять ряду требований – быть относительно недорогой, легкой в использовании, до-

269

пускающей массовое производство, устойчивой и простой в калибровке, оперирующей с малыми количествами неразбавленной цельной крови и одноразовой. Некоторые примеры определения глюкозы приведены в табл. 19.2.

Таблица 19.2. Тест-методы определения глюкозы

Для устранения влияния компонентов крови используют различные дополнительные приемы. Например, для исключения влияния эритроцитов на тест-полоску предварительно наносят декстран с молярной массой (1 – 5)·104. Он препятствует проникновению эритроцитов в зону с реагентами на глюкозу.

С целью одновременного раздельного определения глюкозы и олигосахаридов использовали полоски, на один конец которых наносили реагенты для определения глюкозы, а на другой конец – фермент на олигосахарид.

Был разработан миниатюрный одноразовый амперометрический сенсор для определения глюкозы в сыворотке крови на основе электрополимеризованной полипиррольной пленки. В качестве субстрата биосенсора использована промышленно производимая трехэлектродная система, собранная на плоском корундовом керамическом основании. Рабочий платиновый электрод модифицировали электрогенерированной переокисленной

270