Обробляння результатів

Глюкоамілазну активність ГлСп, од./г (або од./см³), розраховують за формулою:

,

де П₁ – кут обертання площини поляризації дослідного розчину, S₁;

П₂ – ку обертання площини поляризації контрольного розчину, S₂;

0,00243 – масова концентрація глюкози, що відповідає 1S, г/см³;

31 – об’єм суміші, що термостатують, см³;

10⁶ – коефіцієнт переводу г в мкг;

m – маса (об’єм) препарату в робочому розчині, г (см³)

2 – коефіцієнт, який враховує утворення із мальтози двох молекул глюкози;

180 – молярна маса глюкози, мкг/мкмоль.

У випадку застосування освітлення, кінцевий результат, обрахований за формулою, перемножують на коефіцієнт, який враховує зміну об’єму термостатної суміші на 2 см³ за рахунок освітлення, що дорівнює 1,06.

Визначання оцукрюючої активності (ос)

Метод заснованого на гідролізі розчинного крохмалю в межах 25 % глюкозидазних зв’язків досліджуваним Визначанням кількості утворившихся цукрів.

Оцукрююча активність характеризує здатність амілолітичних ферментів каталізувати оцукрення крохмалю до мальтози або мальтози в суміші з глюкозою.

За одиницю оцукрюючої активності прийнято здатність ферменту каталізувати за 1 хв за визначених значень температури і рН розщеплення 1 мкмоля глікозидних зв’язків до відновлених цукрів. Активність виражається в од./г препарату.

Прилади та реактиви

-Апаратура і матеріали – за п. 2.

-Крохмаль розчинний за ГОСТ 10163.

-Натрій оцтовокислий 3-водний за ГОСТ 199, розчин молярної концентрації речовини еквівалентна 1 моль/дм³.

-Натрій фосфорнокислий двозаміщений 12-водний за ГОСТ 4172, розчин молярної концентрації ¹/₁₅ моль/дм³.

-Калій фосфорнокислий одно заміщений за ГОСТ 4198, розчин молярної концентрації ¹/₁₅ моль/дм³.

-Калій двохромовокислий за ГОСТ 4220.

-Кислота соляна за ГОСТ 3118, розчин молярної концентрації

1 моль/дм³.

-Кислота оцтова за ГОСТ 61, розчин молярної концентрації речовини еквівалентна 1 моль/дм³.

-Калій йодистий за ГОСТ 4232.

-Калію гідроксид за ГОСТ 24363 або натрію гідроксид за ГОСТ 4328, розчин молярної концентрації речовини еквівалентна 0,1 моль/дм³.

-Натрій сірчановатистокислий (натрію тіосульфат) за ГОСТ 27068 або фіксанал.

-Кислота сірчана за ГОСТ 4204 (густина ρ = 1,850 г/см³).

-Йод за ГОСТ 4159.

-Вода дистильована за ГОСТ 6709.

Підготовка до визначання

Приготування розчину крохмалю з масовою часткою 1 % (субстрату) – за п.1.

Приготування розчину йоду концентрацією 0,1 моль/дм³.

25,00 г йодистого калію розчиняють в мірній колбі місткістю 1000 см³ в мінімальній кількості дистильованої води і туди ж вносять 12,7 г йоду. Після повного розчинення йоду об’єм розчину доводять дистильованою водою до мітки. Розчин зберігають в склянці із темного скла з притертою пробкою

Приготування розчину сірчановатистого натрію (гіпосульфіту) концентрацією 0,1 моль/дм³.

25,00 г гіпосульфіту розчиняють в мірній колбі місткістю 1000 см³ в невеликій кількості дистильованої води, що не містить вуглецю. Вміст колби перемішують і об’єм рідини доводять до мітки дистильованою водою.

Титр встановлюють за двохромовокислим калієм після витримки розчину гіпосульфіту потягом 15 діб.

Приготування розчину сірчаної кислоти 1:4.

До чотирьох об’ємів дистильованої води додають один об’єм сірчаної кислоти.

Приготування основного розчину очищених ферментів – за п.1.

Приготування основного розчину із повітряно-сухої культури гриба.

5,00 г дослідженої повітряно-сухої культури гриба, який попередньо розтертий в ступці, переносять в конічну колбу місткістю 250 см³, додають 100 см³ дистильованої води і настоюють 1 год при кімнатній температурі, періодично перемішуючи.

Через 1 год розчин фільтрують і фільтрат використовують для аналізу.

Фільтрат зберігають протягом доби при температурі від 2 до 6°С.

Проведення визначання

Беруть дві паралельні наважки дослідного продукту і із кожної роблять не менше двох розведень. Кожне розведення аналізують не менше двох разів.

Визначання оцукрюючої активності в очищених препаратах і культурі гриба, отриманих із Asp. oryzae

В конічну колбу місткістю 50 см³ наливають 20 см³ субстрату (розчин крохмалю, приготовлений на буферному розчині з рН 4,7), колбу закривають годинниковим склом і поміщають в термостат або водяну баню з температурою (30,0±0,2)°С. Через 10 хв. додають від 1 до 10 см³ ферментного розчину (в залежності від передбаченої активності) і вміст старанно перемішують. Загальний об’єм реакційної суміші повинен складати 30 см³. Якщо на Визначання беруть менше 10 см³ ферментного розчину, то відсутній об’єм доповнюють дистильованою водою безпосередньо перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв. після введення ферментного розчину дію ферменту припиняють добавленням 2 см³ розчину соляної кислоти. Потім вміст колби переносять, змиваючи дистильованою водою в конічну колбу місткістю

500 см³, приливають 20 см³ розчину йоду і зразу ж по каплях, старанно перемішуючи, додають 60 см³ розчину гідроксиду натрію або калію.

Колбу закривають і залишають на 15 хв. в захищеному від світла місці. Через 15 хв. в розчин додають 2 см³ сірчаної кислоти і титрують йод, що виділився, розчином гіпосульфіта в присутності індикатора – розчинного крохмалю до зникнення синього забарвлення. Розчин стає безбарвним.

Одночасно ставлять контрольний дослід з тою ж кількістю всіх реагентів, тільки ферментний розчин вводять після добавлення 2 см³ розчину соляної кислоти (без витримки у термостаті).

Різниця між результатами титрування контрольного і дослідного розчинів повинна складати 0,5-6 см³ розчину гіпосульфіту. Якщо різниця менше 0,5 см³ або більше 6 см³, то аналіз повторюють з більшою або меншою кількістю ферментного розчину.