Обробляння результатів

Глюкоамілазну активність (ГлС) в од./г обраховують за формулою:

де m – маса глюкози, що утворилась в 1 см³ гідролізату за рахунок дії ферменту, знайденого за калібровочним графіком, мкг;

m₁ – маса ферменту, що міститься в 1 см³ гідролізата, взятого на визначання, г;

10 – термін гідролізу, хв.;

180 – молекулярна маса глюкози, г/мкмоль.

Визначання глюкоамілазної активності (ГлС) глюкооксидазним методом (арбітражний метод)

Сутність методу полягає у визначенні глюкози, що утворюється при гідролізі мальтози ферментом глюкоамілазою.

Глюкоамілазна активність характеризує здатність ферментного препарату каталізувати гідроліз мальтози з утворенням глюкози і виражається числом одиниць в 1 г (або 1 см³) препарату.

За одиницю активності глюкоамілази приймається здатність фермента каталізувати за визначених значень температури і рН гідроліз 1 мкмоль мальтози до глюкози за 1 хв.

Прилади та реактиви

-Ваги лабораторні загального призначення згідно з ГОСТ 24104.

-Цукромір універсальний СУ-3, СУ-4, автоматичний СП або автоматичні поляриметри А1-ЕПо або А1-ЕПЛ.

-Прилад для вимірювання рН середовища в діапазоні 0-14 з похибкою вимірювання ±0,1 рН.

-Термостат або ультратермостат, який забезпечує температуру нагріву (50±2)°С.

-Термометри за ГОСТ 28498 діапазоном вимірювання 0–100°С і ціною поділки шкали не більше 0,1°С.

-Колби типу Кн місткістю від 100 до 1000 см³ за ГОСТ 25336.

-Колби мірні наливні 1-го або 2-го класу виконання місткістю 100, 200, 250 і 1000 см³ за ГОСТ 1770.

-Воронки типу В за ГОСТ 25336.

-Піпетки типу 2, 1-го і 2-го класу виконання місткістю від 1 до 25 см³ за ГОСТ 29227 або ГОСТ 29169.

-Пробірки П1-21-200, П1-16-150, П2-19-180, або П2-16-150 за ГОСТ 25336.

-Мальтоза перекристалізована для бактеріальних цілей за НД.

-Розчин буферний ацетатний з рН 4,7, приготовлений за ГОСТ 4919.2.

-Кислота соляна за ГОСТ 3118, розчин молярної концентрації

5 моль/дм³.

-Цинк сірчанокислий 7 – водневий за ГОСТ 4174.

-Калій залізистосинеродистий 3 – водний за ГОСТ 4207.

-Вода дистильована за ГОСТ 6709.

Приготування до визначання

Приготування розчину мальтози з масовою часткою 2 % (субстрат).

20,00 г перекристалізованої мальтози, взятої з урахуванням вологи, розчиняють в мірній колбі місткістю 1000 см³ в невеликій кількості води, додають 100 см³ ацетатного буферного розчину, доводять до мітки дистильованою водою і фільтрують. Розчин мальтози готують не менше ніж за добу до його використання, щоб в ньому пройшла мутаротація.

Зберігають розчин при температурі 4-6°С протягом 30 днів. Якщо під час зберігання розчин мальтози помутніє, використовувати його не можна.

Приготування розчину залізистосинеродистого калію

масової частки 15 %.

17,65 г калію залізистосинеродистого кількісно переносять в мірну колбу місткістю 100 см³, перемішують до повного розчинення солі (у випадку необхідності розчин підігрівають) і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування розчину сірчанокислого цинку масовою часткою 30%.

42,85 г сірчанокислого цинку кількісно переносять в мірну колбу місткістю 100 см³, перемішують до повного розчинення солі (у випадку необхідності розчин підігрівають) і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування розчину соляної кислоти концентрації 5 моль/дм³.

430 см³ соляної кислоти поміщають в мірну колбу місткістю 1000 см³, розчиняють і доводять об’єм до мітки дистильованою водою.

Приготування розчинів ферментних препаратів

Приготування основного і робочого розчинів очищених ферментних препаратів.

Основний розчин із очищених ферментних препаратів готують у відповідності із п.2.

Робочий розчин готують із основного, розводячи його дистильованою водою в залежності від передбачуваної активності.

Приготування основного і робочого розчинів із повітряно-сухої культури гриба.

Основний розчин із повітряно-сухої культури гриба готують у відповідності з п.2

Робочий розчин готують із основного, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбачуваної активності.

Приготування розчину із культуральної рідини.

Культуральну рідину фільтрують через паперовий фільтр, повертаючи перші порції назад, досягаючи прозорості розчину.

Від 5 до 20 см³ прозорого розчину культуральної рідини вводять в мірну колбу місткістю 100 см³ і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування розчину із ультраконцентрата.

5 см³ прозорого ультраконцентрату кількісно переносять в мірну колбу місткістю 250 або 500 см³, частково заповнену водою. Об’єм доводять до мітки дистильованою водою і перемішують.

Проведення визначання

Беруть дві паралельні наважки дослідного продукту і із кожної роблять не менше двох розведень. Кожне розведення дослідного розчину аналізують не менше двох разів.

У дві пробірки наливають по 25 см³ розчину мальтози і ставлять в термостат, або водяну баню температурою (50±0,2°С) на 5-10 хв. Потім до вмісту пробірок приливають по 5 см³ розчину дослідного ферментного препарату, швидко перемішують і витримують суміш протягом 15 хв при цій же температурі. Після цього в пробірки додають по 1 см³ розчину соляної кислоти і охолоджують розчини до 20°С.

Одночасно готують контрольну пробу. З цією метою до 25 см³ розчину мальтози доливають спочатку 1 см³ розчину соляної кислоти, потім 5 см³ дослідного розчину ферментного препарату.

Якщо дослідні і контрольні розчини стають мутними, їх освітлюють. Для цього приливають по 1 см³ освітлювачів – розчину сірчанокислого цинку і залізистосинеродистого калію.

Вміст пробірок перемішують і фільтрують. На цукрометрі або автоматичному поляриметрі виміряють кут обертання площини поляризації дослідного і контрольного розчинів, використовуючи поляриметричну трубку (кювету) довжиною 200 мм.