«БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ»

УДК 556+908(476)

Бондарук С.П.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОЗЕР ЮГО-ЗАПАД- НОЙ ЧАСТИ БЕЛАРУСИ

Брестский государственный университет имени А.С. Пушкина, Брест

Актуальность. В качестве объектов исследования, предпринятого нами, выбраны озера юго-западной части Беларуси. Выбор объектов не случаен: обусловлен недостаточностью современных режимных исследований озер в пределах Полесья. Проведение исследований необходимо для определения современного состояния в экосистемах водоемов, а также для более эффективного привлечения водоемов в хозяйственную деятельность.

Впервые комплексные исследования озер Брестского Полесья были проведены в 1967–75 гг. ОНИЛ Озероведения БГУ им. В.И. Ленина под руководством д.г.н., профессора О.Ф. Якушко.

Гидрохимические исследования озер Юго-Западного Полесья изучались неоднократно (Н.Я. Ялынская, 1949, В.А. Кононов, 1958, И.С. Захаренков, 1959). Но, к сожалению, весь материал этих исследований чрезвычайно разнороден, относится к различным пунктам, срокам, неоднороден по объему анализа и трудно сопоставим, а по большинству озер данные вообще отсутствуют. Сопоставимыми можно считать данные, полученные в результате экспедиций ОНИЛ Озероведения БГУ им. В.И. Ленина и данные опубликованные Л.Б. Науменко. (1967, 1976, 1980, 1993 и др.)

Цель исследования. Цель нашего исследования заключается в определении (оценке) экологического состояния озер в юго-западной части Беларуси (территория Брестского Полесья), факторов изменений водной среды и прогнозировании возможных экологических последствий.

Материалы и методы исследования. Исследования проводились на протяжении 2006–2009 гг. В 2006 году сезонные (четырехкратные) полевые исследования были проведены только на 3-х озерах – озера Рогознянской группы (Рогознянское, Белое, Черное), двукратные (зима и лето) – озера Малоритской группы (Дворищанское, Ореховское, Олтушское) и озеро Любань, однократные

– на остальных водоемах. В 2007–2009 гг. проводились исследования в период летней стагнации.

Гидрохимические исследования проводились по стандартным методикам [1]. Для химического анализа использовалась нефильтрованная вода. Определение некоторых гидрохимических параметров проводилось на месте (в полевых условиях) и в лабораториях аналитического контроля при Брестском областном комитете природных ресурсов и охраны окружающей среды.

Использовались разные подходы к определению гидрохимических и физических параметров воды в зимний период и в остальные сезоны года. Для определения кислорода и температуры в зимний период применяли прибор «Экотест 2000», измерения проводились до глубины 3,5 м. Толщина льда и снега измерялась мерной рейкой. Весной, летом и осенью измерение температуры проводилось до дна, гидрохимические показатели определялись в двух горизонтах: 0,2– 0,5 м (приповерхностный слой воды) и у дна. Для этого применяли поверхностный термометр, батометр ГР-18 (Молчанова) со встроенными термометрами. Прозрачность воды определялась по диску Секки.

420

Кроме гидрохимических исследований проводился отбор бентофауны летом 2006 г. на озерах Рогознянской, Малоритской групп и озере Любань. С каждой станции отбирали по две пробы с площади 1/20 м2. Отбор проб производили дночерпателями Экмана-Берджа в модификации Боруцкого на илистых грунтах и дночерпатель Петерсена на песчаных грунтах. Обработку материала производили по методике Е.В. Боруцкого [2].

Результаты исследования и их обсуждение. Показатель концентрации иона водорода (рН) характеризуется постоянным изменением в течение года, для всех исследуемых водоемов характерна слабощелочная реакция воды. Содержание хлоридов в озерах Рогознянской группы колеблется в пределах от 7 до 13 мг/дм3, при средней величине 9 мг/дм3, наибольшими показателями характеризуются оз. Олтуш (37–36 мг/дм3) и оз. Дворищское (32–33). Содержание сульфатов в исследованных озерах изменяется от 8 до 82 мг/дм3. По сравнению с данными 1971–72 гг. содержание сульфатов в воде оз. Белого увеличилось в 4– 10 раз. Содержание сульфатов в озерах изменяется в течение года и с глубиной: больше летом и у дна. Концентрация азота в озерных водах зависит от его потребления и интенсивности процессов распада. При исследованиях озер весной, летом и осенью наибольшее количественное содержание азота отмечается для оз. Черного (0,64 мг/дм3 у поверхности и 5,5 мг/дм3 у дна). Содержание фосфатов колеблется от 0,07 мг/дм3 в приповерхностном слое до 1,4 мг/дм3 у дна.

Произошедшие изменения в содержании гидрохимических элементов не достигают показателей ПДК, поэтому воды исследуемых озер относятся ко II-III классу качества вод.

Термический режим озер можно охарактеризовать как типичный для озер умеренного пояса, зимой характерна обратная стратификация температуры, весной и осенью – гомотермия, летом – прямая стратификация. Особенности кислородного режима на протяжении года определяются особенностями погоды конкретного периода исследования, а также морфометрическими параметрами озер. Наиболее сложные условия наблюдались в период зимней стагнации в мелководных озерах – озера Малоритской группы (зимой 2006, 2007 гг. наблюдались заморные явления).

В отобранных пробах зообентоса было определено 62 таксона (до вида – 34 таксона). Наибольшее видовое разнообразие характерно для оз. Любань (42 таксона), оз. Белого (26 таксонов) и оз. Олтушского (18 таксонов), наименьшим видовым разнообразием отличается оз. Дворищское – 5 таксонов. Среди определенных 62 таксонов бентосных организмов наибольшее распространение получила группа хирономид (27 таксонов).

По сравнению с данными экспедиций, проведенных ранее, в исследуемых озерах Брестского Полесья изменился состав бентофауны с олигохето-моллюско- вой до хирономидной. Большое число хирономид свидетельствует об ухудшении экологических условий водоемов, что подтверждается результатами гидрохимических исследований.

Выводы. Анализ гидрохимических показателей и состояние зообентоса озер юго-запад- ной части Белорусского Полесья свидетельствует о взаимосвязи внутриводоемных процессов с антропогенной нагрузкой водосбора. Современное состояние озер обусловлено включением их в активную хозяйственную деятельность и проявляется в увеличении трофности водоемов. Об увеличении трофности констатирует повышенное содержание биогенных элементов воде (соединения фосфора и азота), изменение кислородного режима, определение сероводорода на глубине (оз. Белое).

Литературные источники.

1.Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши. – Л. : Гидрометеоиздат, 1977. – 545 с.

2.Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / под ред. к.б.н. В.А. Абакумова. – Л.: Гидрометиоиздат, 1983. – 239 с.

421

Bondaruk S.P.

RESEARCH OF AN ECOLOGICAL CONDITION OF LAKES OF A SOUTH-

WEST PART BELARUS

Brest State University named after A.S. Pushkin, Brest

In job presents the results of researches of seven lakes of a southwest part Byelorussian Polesse are given during 2006–2009. The features of hydrochemistry of reservoirs (contents of chemical elements and connections in thicker water), temperature and oxygen modes of lakes within one year, feature zoobentos. The deterioration of a condition ecosystem is marked as a result of activity of the man, which results in increases of lakes.

УДК 577.127.4

Васянович Ю. В., Кукулянская Т. А.

ИЗУЧЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФЛАВОЛИГНАНОВ МИКРОСОМАЛЬНОЙ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ФРАКЦИЯМИ ПЕЧЕНИ КРЫС

Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь

Введение. В основе инактивации и выведения из организма ксенобиотиков лежит процесс их окислительной модификации, представляющий собой первый этап биологической трансформации чужеродных веществ и осуществляемый монооксигеназной системой цитохрома Р450. К огромному числу ксенобиотиков, окисляемых системой цитохрома Р450, относятся природные полифенолы, имеющие большое физиологическое значение для человека и животных (например, флаволигнаны из Расторопши пятнистой – силибинин и силимарин) [1, 2]. Целью данного исследования было изучение возможности окислительной модификации флаволигнанов Расторопши пятнистой – силимарина и силибинина – микросомальной и митохондриальной фракциями печени крыс.

Материалы и методы исследования. В работе были использованы следующие материалы и реактивы: НАДН, НАДФН (Reanal, Венгрия), пероксидаза хрена(Sigma, США), силимарин (Sigma, США), силибинин (Sigma, США), ТМБД (Sigma, США).

В исследовании были использованы методики выделения митохондриальной и микросомальной фракций [3] печени крыс, количественного определения белка по Петерсону [3, 6], определения содержания ТБК-активных продуктов в митохондриальной фракции печени крыс [4]. В основе определения окислительной активности микросомальной и митохондриальной фракций в отношении флаволигнанов и ТМБД в условиях in vitro был положен спектрофотометрический анализ продуктов реакций с использованием спектрофотометра Cary50. Для проведения исследования in vitro экспериментальным путем были подобраны следующие компоненты инкубационной смеси: 40 мМ Трис-HCl буфер (pH 7,4); 16 мМ MgCl2; микросомальная (митохондриальная) фракция (1 мг белка/мл); 300 мкМ субстрат; 300 мкМ НАДФН (НАДН); ±300 мкМ Н2О2.

Результаты исследований и их обсуждение. В данной работе нами была изучена возможность окислительной модификации силимарина и силибинина микросомальной и митохондриальной фракциями печени крыс в присутствии и без пероксида водорода. Было установлено, что инкубация силимарина и силибинина в присутствии данных фракций приводит к значительным изменениям спектральных свойств флаволигнанов. Так, в ходе реакций нами было зарегистрировано уменьшение оптической плотности раствора при λ325 и изменение оптической плотности (увеличение для силимарина и уменьшение для силибинина) при λ285. Исходя из этого можно предположить, что в присутствии микро-

422

сомальной и митохондриальной фракций изученные флаволигнаны, вероятно, подвергаются окислительным превращениям. Внесение в реакционную смесь пероксида водорода приводило к более интенсивному окислению силимарина микросомальной фракцией, о чем свидетельствуют соответствующие спектральные изменения в ходе реакции. Не исключено, что данный эффект реализуется за счет гемопротеинов (например, цитохрома в5 микросомальной фракции), которые могут проявлять псевдопероксидазную активность в отношении некоторых субстратов.

Также нами было исследовано влияние внутрибрюшинного введения силимарина (2 мг/кг массы тела) на окисление силимарина и силибинина микросомальной и митохондриальной фракциями печени крыс. Было установлено, что окислительная модификация флаволигнанов данными фракциями после внутрибрюшинного введения силимарина происходит с большей интенсивностью по сравнению с контролем, о чем свидетельствуют более выраженные изменения оптической плотности раствора при λ285 в ходе данных реакций по сравнению с контрольными экспериментами. В связи с этим можно предположить, что в результате внутрибрюшинного введения силимарина, вероятно, происходит индукция ферментативных систем микросомальной и митохондриальной фракций, осуществляющих окислительные превращения силимарина и силибинина. В ходе исследования также было показано, что пероксид водорода повышает интенсивность микросомального окисления силимарина и митохондриального окисления силимарина и силибинина после внутрибрюшинного введения силимарина, о чем свидетельствуют соответствующие спектральные изменения, полученные в результате реакции. Так как при окислении субстратов в обычных условиях (без введения силимарина) пероксид водорода активировал только микросомальное окисление силимарина, но не влиял на интенсивность митохондриального окисления субстратов, при введении силимарина активировалось и митохондриальное окисление субстратов, можно предположить, что введенный внутрибрюшинно силимарин, вероятно, оказывает свое индуцирующее влияние на гемопротеины митохондриальной фракции (возможно, цитохром с), для которых характерна псевдопероксидазная активность.

Заключение. В ходе проведенной работы была показана возможность окислительной модификации силимарина, силибинина и ТМБД микросомальной и митохондриальной фракциями печени крыс in vitro в присутствии и без пероксида водорода. Было выявлено, что внутрибрюшинное введение силимарина приводит к повышению эффективности процесса окисления силимарина и силибинина и снижению интенсивности накопления продуктов перекисного окисления липидов в митохондриальной фракции печени крыс.

Литература

1.Граник, В. Г. Метаболизм экзогенных соединений. Лекарственные средства и другие ксенобиотики / В. Г. Граник. – М.: Вузовская книга, 2006. – 528 с.

2.Арчаков, А. И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии / А. И. Арчаков, И. И. Карузина // Вестн. АМН СССР. – 1988. – № 1. – С. 14–24.

3.Семак, И. В. Биохимия белков: практикум для студентов биол. фак. спец. / И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич. – Минск: БГУ, 2007. – 49 с.

4.Стальная, И. Д., Гаришвили, Т. Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича – М.: Медицина, 1977. – С. 66–68.

Vasianovich Y. V., Kukulianskaya T. A.

RESEARCH OF FLAVOLIGNANS' OXIDATIVE MODIFICATION BY MICHROSOMAL AND MITOCHONDRIAL FRACTIONS OF RAT'S LIVER

Belarusian State University, Minsk, Belarus

423

Summary

During the first step of the process of biotransformation xenobiotics undergo the oxidative modification by monooxygenase system of cytochrome P450. Among the huge amount of xenobiotics that are oxidized by this system, there are also natural polyphenols that are of great physiological importance for humans and animals (e.g. flavolignans of Silybum marianum – silybinin and silymarin).

The results of the research showed that there is a possibility of oxidative modification of silymarin and silybinine by microsomal and mitochondrial fractions of rat's liver in the presence and in the absence of hydrogen peroxide. It was also revealed that intraperitoneal injection of silymarin (2 mg/kg of body weight) caused the increase in the effectiveness of flavolignan's oxidation by the fractions of rat's liver mentioned above.

УДК 637.144.5:577.1

Головач Т. Н. 1, 2, Курченко В. П. 2, Жабанос Н. К. 1, Червяковский Е. М. 2

ПУТИ СНИЖЕНИЯ АЛЛЕРГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА БЕЛКОВ МОЛОКА И УВЕЛИЧЕНИЯ ИХ УСВОЯЕМОСТИ

1РУП «Институт мясо-молочной промышленности», Минск,

2Белорусский государственный университет, Минск Актуальность. В настоящее время для снижения аллергенности и повышения питательной ценности белков коровьего молока используют различные технологические приемы: ферментативный гидролиз, денатурацию под действием температуры и высокого гидростатического давления и др. Их применение актуально при создании гипоаллергенных детских молочных смесей, продуктов диетического и спортивного питания. В микробиологии и биотехнологии гидролизаты белков молока вносят в питательные среды для культивирования микроорганизмов [1–2]. В качестве белкового компонента для изготовления гидролизатов используют концентраты казеина и сывороточных белков. Молочный белок представлен казеиновой (80 %) и сывороточной фракциями (20 %). Основными сывороточными белками являются β-лактоглобулин (β-лг), α-лак- тальбумин (α-ла), бычий сывороточный альбумин (БСА). Среди белков молока β-лг и казеин обладают наибольшим аллергенным потенциалом [3].

Снижение аллергенного потенциала гидролизатов обусловлено ферментативным расщеплением антигенных детерминант белков молока. Физическое воздействие (тепловая обработка) направлено на изменение конформации белковых молекул, что обеспечивает доступ к ранее скрытым сайтам протеолиза и разрушение областей антигенных детерминант. Создание гипоаллергенного гидролизата для специализированных продуктов предполагает отсутствие нативных белков, степень гидролиза 20–25 %, сбалансированный аминокислотный состав. Положительный физиологический эффект при потреблении частично гидролизованных белков достигается за счет лучшего усвоения короткоцепочечных пептидов в кишечном тракте, чем нативных белков и аминокислот. В то же время при создании микробиологических питательных сред требуется белковый компонент, усваиваемый без дополнительной индукции синтеза бактериальных протеаз, что увеличивает продолжительность накопления биомассы. В связи с этим основным показателем питательной ценности среды является содержание α-аминного азота и подходы, позволяющие увеличить выход свободных аминокислот.

Цель исследования – определение подходов к получению гидролизатов белков молока для продуктов специализированного питания и микробиологических питательных сред.

Материалы и методы. Для изготовления ферментативных гидролизатов использовали концентрат сывороточных белков (КСБ) и сухое обезжиренное мо-

424

локо (СОМ). Протеолиз проводили с примерением сериновых протеаз: алкалазы и трипсина и грибной аминопептидазы (ферментный препарат Novozym, далее новозим). Концентрацию белка в гидролизатах и фильтратах определяли по ГОСТ 30648.2–99. Распределение пептидов по молекулярным массам (Mr) устанавливали путем измерения концентрации белка в образцах, полученных в результате ступенчатого фильтрования фракций гидролизата. Измерение α-амин- ного азота проводили методом формолового титрования по Серенсену, анализ белкового и пептидного профиля – методом ДСН-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), для определения антигенных свойств использовали иммуноферментный анализ.

Результаты исследования и их обсуждение. В качестве молочного сырья для изготовления гидролизатов с целью применения в специализированном питании подобраны концентраты сывороточных белков, характеризующиеся оптимальным аминокислотным составом, лучшим усвоением по сравнению с казеином и высоким содержанием белка. Определена схема технологического процесса изготовления гидролизатов, включающая растворение сухого КСБ, предварительную тепловую обработку белкового субстрата, ферментативный гидролиз в оптимальных условиях, термоинактивацию фермента и фильтрацию. Показано, что алкалаза эффективно расщепляет нативные β-лг и α-ла; гидролиз БСА возможен лишь после тепловой обработки. Для удаления нативного БСА (рис. 1) и пептидов с Mr>10 кДа необходима фильтрация (табл. 1).

Распределение продуктов протеолиза термизированного КСБ алкалазой по молекулярным массам показано в табл. 1.

Таблица 1 – Характеристика пептидного профиля ферментативного гид- ролизата КСБ

Отношение α-аминного азота к общему (AN/TN) в полученном образце составило 20,2 %. Установлено, что способность связывать антитела против основных сывороточных белков гидролизатом КСБ уменьшается до 25–27 %, а фильтратом 10 кДа – до 3–5 %. Таким образом, предложенная технология позволяет получить частичный гидролизат сывороточных белков, пригодный для использования в гипоаллергенных молочных смесях. Для увеличения степени протеолиза белковых субстратов за счет возрастания доли короткоцепочечных пептидов предложено комплексное использование эндопептидаз: алкалазы и трипсина. Так, в гидролизате нативного КСБ алкалазой AN/TN достигало 17,8 %, трипсином – 18,6 %, трипсином и алкалазой – 22,1 %.

С целью получения гидролизата для микробиологических питательных сред использовали сухое обезжиренное молоко, соответствующее естественным потребностям молочнокислых бактерий в углеводном, минеральном и белковом компонентах. Для протеолиза СОМ применяли бактериальную эндопептидазу – алкалазу. В конечном гидролизате СОМ не обнаружена высокомолекулярная белковая фракция (рис. 2а), количество α-аминного азота составило 56 мг %. В то же время при комплексном внесении алкалазы и новозима (экзопептидазы),

425

содержание α-аминного азота увеличилось до 73 мг %, наблюдалось расщепление пептидной фракции, выявленной в гидролизате СОМ алкалазой (рис. 2а,б: 3–5). Внесение новозима позволило увеличить выход аминокислот и короткоцепочечных пептидов.

Выводы. Таким образом, для получения частичных гидролизатов сывороточных белков в качестве компонента продуктов специализированного питания предложены комплексная тепловая обработка белкового субстрата и последующий гидролиз, а также совместное использование эндопептидаз (алкалазы и трипсина). Одновременное внесение ферментов с эндо- и экзопептидазной активностью (алкалазы и новозима) позволило получить гидролизованный белковый компонент на основе СОМ с высоким содержанием α-аминного азота.

Литература

1.Frokjaer, S. // Food Technology. – 1994. – Vol. 48, № 10. – P. 86–88.

2.Clemente, A. // Trends in Food Science and Technology. – 2000. – Vol. 11. – Р. 254–262.

3.Paschke A., Besler M. // Ann. Allergy Asthma Immunol. – 2002. – Vol. 89. – P. 16–20.

Halavach T. N. 1, 2, Kurchenko V. P. 2, Zhabanos N. K. 1, Cherviakovsky E. M. 2

THE WAYS TO REDUCE THE ALLERGENIC POTENTIAL OF MILK PRO-

TEINS AND INCREASE THEIR DIGESTIBILITY

1RUF «Institute of Meat and Dairy Industry», Minsk

2Belarusian State University, Minsk

Summary

Approaches to obtaining of milk proteins hydrolysates for specialized foods and microbiological growth media have been determined. The method of hypoallergenic partial hydrolysates making involve a preliminary heating of whey proteins, proteolysis with endopeptidase(s) and filtering. Hydrolysate of skim milk for microbiological culture media with high level of α-amino nitrogen has been received.

УДК 577.112.083+577.152.231

Грицук О. Е., Бондарюк Е. В.

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ПРЕПАРАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ АСПАРТАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ СЕРДЦА СВИНЬИ МЕТОДАМИ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Белорусский государственный университет, Минск

Аспартат-аминотрансфераза (L-аспартат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, КФ 2.6.1.1) является ключевым ферментом азотистого обмена в клетках как животных, так и растений и микроорганизмов. Впервые аспартатаминотрансфераза (АспАТ) с высокой степенью чистоты была выделена из сердца свиньи в 1958 г. [1]. Позже было показано, что в клетках млекопитающих существуют две формы АспАТ: цитоплазматическая (ц-АспАТ) и митохондриальная (м-АспАТ) [2], которые отличаются по физико-химическим и каталитическим свойствам. Форма м-АспАТ служит модельным объектом для изучения воздействия окислительного стресса на клетку, поэтому первым этапом в этой работе является получение гомогенного препарата фермента.

Описан ряд методических подходов, применяемых для очистки м-АспАТ как из грубого клеточного экстракта, так и из предварительно очищенного препарата митохондрий [3]. Эти методы включают фракционирование сульфатом аммония, нагревание, ионообменную хроматографию на различных носителях и гель-фильтрацию. Их использование в различных комбинациях позволяет полу-

426