9.4. Ферменты как биологические катализаторы

Химические процессы в живых организмах осуществляются при помощи биологических катализаторов – ферментов. Все известные в настоящее время ферменты являются белками, многие из которых содержат ионы металлов.

По эффективности ферменты значительно превосходят химические катализаторы. Во многом это обусловлено тем, что ферменты резко снижают энергетические барьеры на реакционном пути. Например, энергия активации для реакции распада перекиси водорода под действием иона железа (II) и молекулы каталазы соответственно 42 и 7,1 кДж/моль, для гидролиза мочевины кислотой и уреазой – 103 и 28 кДж/моль соответственно.

Кроме того, ферменты отличает высокая специфичность и направленность действия. Так, амилаза, содержащаяся в слюне, легко и быстро расщепляет крахмал, молекула которого состоит из большого числа одинаковых глюкозных звеньев. Но она не катализирует процесс распада сахарозы.

Каталитические действия ферментов происходят в сравнительно «мягких» условиях (t= 37–40^oC, при невысоком давлении и определенном значении рН).

9.5. Кинетика реакций, катализируемых ферментами

Уже в ранних исследованиях по влиянию концентрации реагента на скорость ферментативных реакций была обнаружена очень важная особенность ферментативного катализа, которая заключается в сложном характере кинетики этих реакций. Так, при низких концентрациях реагента (или субстрата) реакция протекает в соответствии с уравнением первого порядка. При высоких концентрациях субстрата скорость перестает зависеть от концентрации и, таким образом, реакция в этих условиях протекает в соответствии с уравнением нулевого порядка. Общий вид зависимости скорости реакции от концентрации субстрата при такой двухступенчатой кинетике приведен на рис. 9.1.

Рис. 9.1. Зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата

Л. Анри первым предположил, что фермент образует промежуточное соединение или комплекс с субстратом. При высоких концентрациях субстрата весь фермент будет в комплексе с субстратом и скорость реакции будет максимальной. Иными словами, в реакциях, катализируемых ферментами, стадией, определяющей скорость процесса, будет стадия распада комплекса на фермент и продукт. Она носит название лимитирующей стадии всего процесса.

Обозначим фермент Е, а субстратSи запишем уравнение ферментативной реакции.

Образование комплекса:

(быстрая стадия). (9.1)

Распад комплекса:

(медленная стадия), (9.2)

V₁=k₂[ES]. (9.3)

Такие реакции как в химической, так и ферментативной кинетике носят название сложных. Их можно решать как равновесным, так и методом стационарного состояния.

Равновесный методдает хорошие результаты, если состояние, близкое к равновесному, устанавливается на быстрой стадии. Именно этим методом Михаэлис и Ментен провели математическую обработку экспериментальных данных, подобных представленным на рис. 9.1. Сложность решения заключается в том, что необходимо выразить концентрацию равновесную [ES] через величины, которые можно измерить количественно. Это позволяет исключить [ES] из уравнения скорости реакции. Константа равновесия первой стадии может быть представлена в виде

. (9.4)

Следовательно

. (9.5)

На этом этапе задача еще не решена, потому что [E] – это концентрация свободного фермента, которую также трудно измерить экспериментально. Однако в состоянии равновесия содержаниеЕ_своб.иЕ_связ.можно выразить черезЕ_t, гдеЕ _t– общая концентрация фермента:

[E_t] = [E_своб.] + [ES]. (9.6)

Это уравнение носит название уравнения постоянства общей концентрации фермента. Общая концентрация фермента может быть измерена. Множитель в уравнении (9.5) можно заменить на разность [E_t] – [ES]. В результате уравнение примет вид

. (9.7)

Решая его относительно [ES], получим:

. (9.8)

Вместо k_-1/k₁введемК_М. Новая константа по своей сути является константой диссоциации фермент/субстратного комплексаES, в то время какК, входящая в уравнение (9.4), является константой его образования. Новую константу, численно равную отношениюk_-1/k₁, называют константой Михаэлиса и обозначают обычно какКм. Тогда уравнение (9.8) принимает вид

. (9.9)

Теперь мы имеем выражение, которое можно подставить в общее уравнение скорости: V=k₂[ES] и получим

. (9.10)

Сделаем еще одно упрощение: когда весь фермент связывается с субстратом (при высокой концентрации субстрата), скорость становится максимальной. Свободного фермента уже нет и [E_t] = [ES]. В этих условиях скорость реакции обозначаютV_max. ВеличинаV_maxявляется константой, характеризующей реакцию в условиях, когда она протекает по уравнению нулевого порядка. Это уравнение имеет вид

V_max= k₂[E_t],

и тогда уравнение (9.10) примет вид

.

В результате такой подстановки мы имеем уравнение Михаэлиса-Ментен, позволяющее легко измерять максимальную скорость из экспериментальных данных, тогда как величины E_tиk₂ определять сложнее.

Конечно, сегодня имеется ряд очищенных ферментов с известным молекулярным весом и для них можно рассчитать молярную концентрацию E_t. Но для всех неочищенных препаратов, а также для ферментов с неизвестным молекулярным весом применениеV_maxвместоk₂[E_t] существенно упрощает расчеты.

Действительно, по этому уравнению, если концентрация Sмала по сравнению сК_М, то член [S] можно исключить из знаменателя, и уравнение Михаэлиса-Ментен приобретает вид

(первый порядок).

При высоких концентрациях субстрата можно считать, что величина [S] значительно большеК_М. При этом

V = V_max= const (нулевой порядок).

Считается, что при изучении многих реакций, катализируемых ферментами, лучше пользоваться не равновесным методом, а методом стационарного состояния. Рассмотрим, как в этом случае будут различаться окончательные уравнения скорости.

Начальные стадии в обоих вариантах одинаковы:

;

;

скорость = k₂[ES].

После достижения стационарного состояния [ES] будет постоянна и, следовательно, скорость ее изменения будет равна нулю:

d[ES]/dt = 0 = k₁[E][S] – (k _–1[ES] + k₂[ES]) (9.11)

образование исчезновение

. (9.12)

Различие между выражением (9.12) и (9.5) заключается в константах: равновесный метод дает член k₁/k_–1, а метод стационарного состояния – членk₁/(k _–1 +k₂). Обратной величиной последнего будет новая константа, а именно константа МихаэлисаК_Мв условиях стационарного состояния. Все остальные преобразования аналогичны первому случаю. Окончательная форма записи уравнения скорости в условиях стационарного состояния реакции имеет вид

. (9.13)

Это и есть уравнение скорости, которое применяется в ферментативной кинетике, если нет убедительных данных, свидетельствующих о том, что начальная стадия реакции быстро приходит к равновесию.

Поскольку уравнения (9.13) и (9.11) являются уравнениями гиперболы, графически определить постоянные величины К_mиV_maxдовольно трудно, поэтому уравнение Михаэлиса-Ментен было преобразовано в другие более удобные формы. Одна из них – форма уравнения Лайнуивера-Берка. Если уравнение (9.13) записать в обычной форме, а затем обе стороны уравнения выразить в виде обратных величин, то получаем равенство

. (9.14)

Правую часть уравнения можно представить так:

. (9.15)

Две переменные Vи [S] теперь разделены, и если построить график в координатах (1/V,1/[S], то мы получим прямую линию с наклоном, равнымК_m/V_max,пересекающую ось 1/Vв точке 1/V_max.

Однако для некоторых ферментативных систем график, построенный в этих координатах, может отличаться от прямой линии. Это, возможно, обусловлено тем, что при избыточных концентрациях субстрата фермент может ингибироваться или активироваться субстратом. Для аллостерических ферментов кривые насыщения субстратом обычно имеют сигмоидную форму и часто могут быть описаны уравнением, в котором [S] заменено на [S]ⁿ. Если аномалии появляются экспериментально при низких концентрациях субстрата, то соответствующие точки будут находиться только в правой части графика. Следовательно, эти аномалии не должны мешать расчету величинK_mиV_max. Если же отклонения от линейности обнаруживаются при высоких концентрациях субстрата, то соответствующие точки будут находиться рядом с точкой пересечения и возникнет проблема с экстраполяцией линейных участков полученной кривой. В таких случаях может быть использована другая форма уравнения Лайнуивера-Берка. Для этого умножим обе части уравнения (9.15) на [S] и получим:

. (9.16)

Построение графика в координатах [S]/VиSдает прямую линию с наклоном, равным 1/V_max, пересекающую ось [S]/Vв точкеK_m/V_max. Все отклонения от графика, проявляющиеся при больших значениях [S], будут находиться в правой части графика и с ними можно не считаться.

Упомянем еще об одной часто применяемой альтернативной форме уравнения Михаэлиса-Ментен, поскольку она обладает тем преимуществом, что позволяет заметить такие отклонения от линейности, которые могли быть пропущены в случае других графиков.

Если умножить уравнение (9.15) на V_max·Vи произвести соответствующие преобразования, то получим:

. (9.17)

Отметим, что точка пересечения прямой с осью ординат соответствует V_max, точка пересечения с осью абсцисс соответствует величинеV_max/K_m, а наклон прямой равен –K_m.

В настоящее время для анализа кинетических параметров ферментативных реакций все больше используется ЭВМ, что расширяет перечень подходов и делает анализ более объективным.