Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_4763_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
41
I этап заключался в наборе пациентов и их обследовании в рамках
поставленных задач. Все пациенты приступили к участию в исследовании в течение
одного и того же эпидемического сезона.
В качестве критерия для включения участников в группу РРИ нами
использован инфекционный индекс (ИИ) и индекс резистентности (J), а также
количество эпизодов заболевания выше 6 для раннего и выше 8 для дошкольного
возраста за предшествующий календарный год [6,9].
Все дети с РРИ, предполагаемые к участию в исследовании, находились под
наблюдением одного врача-педиатра в течение 3 месяцев перед включением в
исследование с целью рандомизации групп. Терапия возникавших эпизодов ОРВИ в
течение этого периода осуществлялась исключительно синдромально, без
использования местных антисептических и антибактериальных препаратов,
системных антибактериальных препаратов, а также противовирусных,
иммуномодулирующих и пробиотических препаратов. Дети, получившие данные
группы препаратов, к участию в исследовании допущены не были. Также не были
допущены к участию в исследовании дети, посещающие детские коллективы сроком
менее 1 года, как не прошедшие первичную адаптацию, характеризующуюся более
высокой заболеваемостью ОРВИ.
Процент участников исследования, посещающих организованные детские
коллективы, является идентичным в группе «условно здоровых» детей (12 человек) и
группе детей с РРИ (60 человек), что составляет 80 % участников групп.
На старте исследования всем участникам дана оценка частоты заболеваемости
респираторными инфекциями ВДП, определена структура заболеваемости, ведущие
факторы риска в формировании частоты заболеваемости ОРВИ и возникновении
осложнений в течение данных инфекции. Проведено формирование групп
пациентов. Разбиение детей с РРИ на группы проводилось методом случайных
чисел. Для определения минимального количества пациентов в каждой группе в
42
качестве первичной контрольной точки выбрана концентрация Actinobacteriota в
кишечнике у пациентов до и после проведенного курса.
Различия считались значимыми при р <0,05. Желаемая мощность
исследования (1-β) составляет 80%. В качестве уровня минимальной клинической
значимости приняты различия в концентрации микроорганизма до и после
проведенного лечения в 0,8%. Значение стандартного отклонения в пилотном
эксперименте (на примере 15 пациентов) составило 0,75%.
Дальнейшие расчеты произведены по формуле Лера.
N = 16 / (σ / SD)
2
= 16 / (0,8/ 0,75)
2
= 16 / 1,0667
2
= 16/1,138 ≈ 14 (1),
где N – минимальное количество пациентов в одной группе,
σ – минимальная клинически значимая разница,
SВ – стандартное отклонение
Таким образом, исходя из указанных значений, минимальное количество
пациентов для каждой группы наблюдений должно составлять не менее 14 человек.
В этом случае число отобранных участников при таргетировании позволяет
полноценно и достоверно анализировать полученные математические результаты
исследования.
Контрольная группа включила 15 детей возраста от 1 года до 6 лет. Данную
группу составили «условно здоровые» дети с частотой эпизодов ОРВИ до 3 случаев
за предшествующий календарный год. Участники группы были однократно
обследованы, не получали курса профилактики, но наблюдались на протяжении
всего периода выполнения исследования одним и тем же врачом педиатром, с
оценкой параметров заболеваемости – частоты эпизодов ОРВИ, длительности и
потребности в антибактериальной терапии при осложненном течении, пройдя при
этом те же эпидсезоны, что и остальные участники исследования. Данные по
заболеваемости КГ на протяжении всего периода исследования были в дальнейшем
использованы при сопоставлении заболеваемости в качестве клинической оценки
43
результатов курса профилактики. Группа сравнения включила 15 детей
сопоставимых по полу и возрасту. Все дети, на основании изучения амбулаторных
карт, относились к группе детей с РРИ. Дети из группы сравнения были обследованы
двухкратно – на старте исследования и спустя трехмесячный срок - с целью
сравнения с пациентами ОГ, наблюдались на протяжении всего периода выполнения
исследования одним и тем же врачом педиатром и получали стандартную
профилактику ОРВИ.
Основная группа включила 60 детей, сопоставимых по полу и возрасту. Все
дети, на основании изучения амбулаторных карт, относились к группе детей с РРИ.
Этиологическая верификация ОРВИ не проводилась.
В основной группе выделена ОГ
1
, ОГ
2
и ОГ
3
– по 20 участников каждая, в
соответствии с получаемым участниками курсом профилактики.
II этап был представлен анализом полученных данных, на основании которых
осуществлена разработка и применение патогенетически обоснованных схем
профилактики частых ОРВИ.
Участники основной группы обследованы дважды – на старте исследования и
спустя 3-месячный срок проведения курса профилактики, и также наблюдались на
протяжении всего периода исследования одним врачом педиатром, что позволило
создать доверительные отношения между врачом и пациентом, обеспечивая
приверженность к выполнению всех рекомендаций, и, как результат, повысить
эффективность курса профилактики.
III этап – анализ полученных данных обследования пациентов + оценка
параметров заболеваемости в течение 3 месяцев прохождения курса. Затем, все
участники исследования находились под наблюдением врача педиатра на
протяжении еще 12 месяцев от завершения курса, для эффективной оценки
параметров заболеваемости ОРВИ. На основании полученных данных созданы
44
персонифицированные алгоритмы и программы профилактики РРИ у детей путем
коррекции состава микробиома. Дизайн исследования представлен на рисунке 4.
Рисунок 4 – Дизайн исследования
Участники на протяжении исследования, при выявлении эпизодов ОРВИ
получали идентичную симптоматическую терапию: жаропонижающие препараты
(Парацетамол сироп, Ибупрофен сироп в соответствии с инструкцией
производителя), солевые растворы для орошения слизистых оболочек горла и носа,
сосудосуживающие капли в нос (Ксилометазолин, Оксиметазолин в соответствии с
инструкцией производителя).
45
Родители всех обследуемых пациентов подтвердили свое участие в
исследовании посредством подписания добровольного информированного согласия.
Критерии включения пациентов в исследование:
1. Возраст ребенка от 1 года до 6 лет включительно.
2. Частота эпизодов ОРВИ выше 6 для раннего и выше 8 для дошкольного
возраста (ребенок относится к группе РРИ- для включения в основную группу
и группу сравнения).
3. Отсутствие признаков острого инфекционного заболевания, а также очагов
острого воспалительного процесса в оро-фарингеальной зоне
(фарингит/тонзиллит/тонзиллофарингит) на момент включения в
исследование.
4. Отсутствие антибактериальной терапии на протяжении 3 месяцев перед
стартом исследования.
5. Отсутствие отклонений в физическом и нервно-психическом развитии
ребенка, диспансерного учета по поводу хронических заболеваний и
врожденных пороков развития, хромосомной патологии.
6. Отсутствие медикаментозной поддержки или базисной терапии по поводу
сопутствующих заболеваний.
7. Отсутствие манифестных/выраженных аллергических проявлений
(атопический дерматит, аллергический ринит, бронхиальная астма).
К критериям невключения пациентов в исследование относились:
1. Участие в каких-либо клинических исследованиях в течение предыдущего
месяца и на текущий момент времени.
2. Отсутствие вакцинации от коклюша и гемофильной инфекции (с целью
однородности групп и клинических проявлений в периоде прохождения
исследования, а также исключения факторов, осложняющих течение ОРВИ)
46
3. Отказ пациента принимать участие в исследовании, отсутствие готовности к
сотрудничеству со стороны пациента/его законных представителей,
невозможность понять суть исследования и следовать рекомендациям.
К критериям исключения пациентов из исследования относились:
1. Индивидуальная непереносимость применяемой схемы профилактики.
2.2. Клинические и лабораторные методы исследования
Для оценки особенностей развития и течения заболевания, факторов риска и
динамики клинических проявлений, был разработан опросник для родителей с
перечнем вопросов, отражающих перинатальный период, характер вскармливания,
гинекологический анамнез матери, наследственный и отягощенный анамнез, а также
вредные привычки родителей. Учитывались сведения о вакцинации согласно
Национальному прививочному календарю. Все участники исследования
наблюдаются одним педиатром частного медицинского центра ООО «Центр
современной педиатрии» с рождения, вакцинация в рамках Национального
календаря проводилась с использованием комплексных зарубежных вакцин,
зарегистрированных на территории РФ, ввиду чего каждый участник исследования
получил полную схему профилактики не только коклюша, но и гемофильной
инфекции соответственно своему возрасту. Учтены клинико-функциональные
характеристики пациентов, переносимость лекарственных препаратов, частота
курсов системной и местной антибактериальной терапии за предшествующий
календарный год, витаминотерапия, курсовой прием биопрепаратов.
Клинический осмотр осуществлен в соответствии со стандартными
критериями педиатрического осмотра. Вес и рост измерены на приеме врачом
педиатром. Всем детям проведена оценка физического развития (индекс массы тела
(ИМТ), антропометрические показатели WAZ, HAZ, BAZ).
47
Всем участникам проведены общеклинические исследования (общий анализ
крови, общий анализ мочи).
Проводилась риноцитограмма (микроскопическое и цитологическое
исследование мазка со слизистой носа, окрашенного по Романовскому-Гимзе).
Осуществлялось определение суммарного иммуноглобулина А в сыворотке
крови, для чего применялся метод иммунотурбидиметрии с помощью прибора Cobas
6000, Roche Diagnostics, Швейцария.
На каждого пациента в обязательном порядке была заведена индивидуальная
карта, в которой отмечались все данные анамнеза, жалобы, показатели клинического
осмотра, данные лабораторных исследований и генетического секвенирования,
клинический диагноз и схема курса профилактики.
2.3. Генетическое секвенирование образцов биоматериала
В соответствии с целью работы всем участникам исследования в период
клинического благополучия был осуществлен забор мазка с задней стенки глотки, а
также забор анализа кала.
Забор мазка с задней стенки глотки и анализа кала осуществлялся при помощи
стандартной цитощетки (зонд урогенитальный одноразовый стерильный тип D
«Цитощетка»), помещаемой, после забора материала, в пробирку
микроцентрифужную (Эппендорфа), после чего материал замораживался при
температуре -20 градусов по Цельсию. Транспортировка биоматериала в
лабораторию осуществлялась в температурном режиме – 20 градусов по Цельсию с
соблюдением холодовой цепи (контроль – датчик температуры).
Качественное и количественное изучение состава микробиома ротоглотки и
кишечника проводилось методом генетического секвенирования региона V3-V4 гена
16S рРНК и последующего биоинформатического анализа результатов на базе
«Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины имени
48
академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУ
ФНКЦ ФХМ им. Ю. М. Лопухина ФМБА РОССИИ), лаборатория геномных
исследований и вычислительной биологии.
Выделение ДНК из образцов:
Из полученных образцов была выделена ДНК на автоматической станции King
Fisher Flex (Thermo Fisher Scientific, США). Мазки были выделены набором
MagMAX ™ DNA Multi-Sample Ultra 2.0 Kit (Thermo Fisher Scientific, США), а
образцы фекалий выделяли набором MagMAX™ Microbiome Ultra Nucleic Acid
Isolation Kit, with bead tubes (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с
инструкцией производителей.
Измерение концентрации образцов:
После выделения ДНК из образцов измеряли концентрацию полученной ДНК
набором QUBIT DNA BR ASSAY KIT (Thermo Fisher Scientific, США) в
соответствии с инструкцией производителей.
Приготовление библиотек:
Приготовление библиотек для секвенирования проводилось в соответствии с
протоколом 16S Metagenomic Sequencing Library preparation для прибора MiSeq,
Illumina. Для этого использовали вариабельный участок гена 16S РНК, регион V3-
V4. Для приготовления библиотек использовались праймеры 341F и 801R для
амплификации региона V3-V4 гена 16S рРНК, содержащие на 5’-конце
последовательности, необходимые для дальнейшего лигирования индексирующих
образцы праймеров. Для получения необходимых ПЦР фрагментов использовали 2
раунда ПЦР. Праймеры были синтезированы фирмой Evrogen (Россия). ПЦР
проводили набором Tersus PCR kit (Evrogen, Россия) в соответствии с инструкцией
производителя.
После амплификации наличие ПЦР продуктов проверяли в 1,5% агарозном
геле. После проведения первой стадии ПЦР проводили чистку продукта с
49
использованием 0,8 объема KAPA Pure Beads (Roche) в соответствии с инструкцией
производителя. После чистки ампликонов проводили II раунд ПЦР, лигирование
индексирующих баркодов. После второго раунда для оценки качества протекания
ПЦР проводили горизонтальный электрофорез в 1,5% агарозном геле. Количество
продукта ПЦР оценивали на приборе Qubit fluorometer с использованием Quanti-iT
dsDNA BR Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Полученные библиотеки
смешивали в эквимолярном количестве в соответствии с измеренной концентрацией.
После эквимолярного объединения библиотек проводилась проверка их качества на
биоаналайзере Agilent 2100. Полученный общий микс библиотек, с измеренной
концентрацией, хранился в низкоадгезионных пробирках при -20ºC.
Секвенирование:
Дальнейшее секвенирование полученной библиотеки проводилось по
протоколу для прибора MiSeq, Illumina. Предварительную оценку качества
результатов секвенирования определяли на основании стандартного отчета,
автоматически создаваемого прибором по завершению запуска с учетом допустимых
границ параметров, заявленных производителем.
Обработка данных:
Качество полученных данных на Illumina MiSeq в формате. Fastq проверялось
с помощью программы FastQC
(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Для дальнейшей
обработки данных и получения таксономических профилей использован пакет
DADA2 (https://www.nature.com/articles/nmeth.3869).
50
2.4. Применяемые методы программы профилактики
На основании результатов генетического секвенирования, по изменениям в
составе микробиома, были сформированы диетические рекомендации для
участников ОГ
1
и ОГ
3
. При формировании диетических рекомендаций был
использован персонализированный подход к каждому участнику групп, с учетом
ИМТ ребенка, вкусовых предпочтений, а также принципов питания семьи.
Диетические рекомендации включили:
1. Сокращение/исключение продуктов, негативно влияющих на
воспалительный каскад: простые углеводы, добавленный сахар, магазинные
фруктовые соки, сладкие газированные напитки, сладкие молочные продукты
(сладкие йогурты, сладкие творожки, мороженое), фаст фуд, транс-жиры («частично
гидрогенизированные жиры»), полуфабрикаты, мясные колбасы, консервы,
магазинная выпечка, сладости.
2. Обогащение рациона:
- клетчатка (пищевые волокна) овощи, фрукты, бобовые, семечки, орехи,
цельнозерновые.
- устойчивый (резистентный) крахмал: зеленые бананы, манго, бобовые,
семена, зерновой хлеб, остывшие после приготовления продукты: рис, паста,
картофель.
- биоактивные полифенолы: зеленый чай, горький шоколад.
- пребиотики: инулин (груши, бананы, лук, спаржа, чеснок), яблочный пектин
(яблоки), квашеная капуста без уксуса.
- молочнокислые продукты без добавления сахара.
- злаки: цельнозерновые продукты, отруби.
- полиненасыщенные жирные кислоты (растительные масла, орехи, семена,
рыба).
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана