Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_4763_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
31
двунаправленной петлей, взаимосвязь которой стимулируется изменениями в
местном иммунитете кишечника или дыхательных путях.
1.4. Сравнительная оценка методов исследования микробиома.
Молекулярная генетика микроорганизмов
Сравнительная оценка методов исследования микробиома представлена в
таблице 3 [13].
Основной труд исследователей на современном этапе направлен на
молекулярную генетику микроорганизмов, как на наиболее перспективную и
быстроразвивающуюся область науки.
За последние два десятилетия, благодаря внедрению метода секвенирования
ДНК по фрагменту гена 16S рРНК, возможности изучения состава,
ассоциированного с хозяином микробиома значительно расширились. Изменилось
представление о бактериальном разнообразии, установлено, что около 80%
бактерий, выявленных путем молекулярной диагностики, являются
некультивируемыми.
Ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК (16S rRNA) является идеальным
генетическим маркёром для изучения бактерий.
Этот ген есть в геноме всех известных бактерий и архей, в связи с чем может
быть использован для их идентификации [3,44]. Анализ вариабельных участков гена
16s rRNA проводится с использованием различных технологий секвенирования:
секвенирование по Сенгеру (секвенирование первого поколения);
пиросеквенирование; технология секвенирования на основе Illumina;
высокопроизводительное секвенирование, обладает преимуществом высокой
скорости, низкой стоимости и высокой точности (секвенирование следующего
поколения (NGS), секвенирование третьего поколения, которое позволяет проводить
секвенирование отдельных молекул РНК [94].
32
Таблица 3 – Сравнительная оценка методов исследования микробиома
Метод
исследования
Описание
Преимущества
Недостатки
Культуральные
методы
Выделение из питательной
среды бактерий определённ
ого вида путём
культивирования, с их
последующей видовой
идентификацией на
основании изучения
морфологических,
культуральных,
биохимических,
серологических,
биологических,
экологических
характеристик
микроорганизмов.
Высокая
распространенность,
доступность, простота
интерпретации
результатов,
относительно низкая
стоимость
Трудоемкость,
исключительная
долговременность
проведения
исследования, в
аэробных условиях
может быть
культивирован очень
низкий процент
микроорганизмов
Количественная
ПЦР
Метод основан на
репликации ДНК-
полимеразой нуклеотидной
последовательности,
характерной для
определенного вида
микроорганизмов, что
позволяет существенно
увеличить число копий
(амплифицировать)
специфического фрагмента
ДНК (РНК) в исследуемой
биологической пробе in
vitro от ничтожно малых
количеств до
обнаруживаемых величин.
В результате этого
происходит усиление
сигнала в реакционной
смеси, что позволяет
обнаружить и
идентифицировать
специфический участок
генома
возбудителя.
Высокая
чувствительность и
специфичность,
возможность получения
быстрого результата,
возможность не только
качественной, но и
количественной
оценки.
Возможность
ложноположительны
х результатов
вследствие высокой
чувствительности, а
также
ложноотрицательны
х результатов
вследствие
амплификации ДНК
(РНК) погибшего
микроорганизма.
Определяется
ограниченное число
видов
микроорганизмов.
33
Продолжение таблицы 3.
Метод
исследования
Описание
Преимущества
Недостатки
Газовая
хроматография-
масс-
спектрометрия
(ХМС)
Определение в
биологических пробах
компонентов клеточных
стенок микроорганизмов -
микробных маркеров из
числа высших жирных
кислот. Методика основана
на разделении смеси
веществ с последующим
установлением их
структуры путем ионизации
и образования компонентов
со специфическим
соотношением массы и
заряда.
Высокая
чувствительность,
достоверность и
универсальность.
Высокая скорость
выполнения.
Количественная
оценка.
Идентификация
микроорганизмов
ограничена только
теми компонентами,
которые определены
у ранее
исследованных
микробов.
NGS-
секвенирование
гена 16S рРНК
(next generation
sequencing)
Определение вариантов
(генных полиморфизмов) в
конкретных
(гипервариабельных)
участках этого гена
методом секвенирования
следующего поколения
(NGS), что дает
возможность выявить все
виды бактерий в
биоматериале.
Как и количественная
ПЦР, метод позволяет
выявлять как живые,
так и погибшие
бактерии, а также
определять видовые
различия микробов.
Простота в исполнении,
использование
универсальных
праймеров для
амплификации,
наличие баз данных
микробиоты для
сравнения полученного
результата.
Не дает оценки
числа генокопий
микробов, а только
процент данных
бактерий от их
общего числа.
Широкий разброс
оценок разнообразия
видов.
Неспособность
оценить
биологические
функции
микроорганизмов.
Полногеномное
секвенирование
Изучение
последовательности
отдельных фрагментов всех
ДНК, выделенных от
некультивированной
микрофлоры
Возможность не только
идентифицировать
микроорганизм, но и
определить его
биологические
функции,
закодированные в
геноме, что формирует
наиболее полную
картину представления
о изучаемом виде
Высокая стоимость
Большой объем и
сложность анализа
полученной
информации.
Отсутствие полных
баз данных по
некоторым таксонам
микробиоты.
34
Достижения в области высокопроизводительных технологий секвенирования,
а также появление новых методик анализа и статистической обработки данных
привело к тому, что применение методики генетического секвенирования для
определения геномного состава микробиоты значительно расширилось, позволяя
использовать ее как рутинный метод для определения бактериальных таксонов, и
послужило развитию нового направления в науке - метагеномики.
В результате были созданы полномасштабные проекты по изучению
микробиома человека - «Проект микробиома человека» (Human Microbiome
Project,2008г, США) и Проект MetaHIT (финансируемый Европейской комиссией,
2008г.). Результатом их работы явилось определение преобладающих бактериальных
таксонов микробиома кишечника человека [108].
Изучение человеческого микробиома также проводится на международном
уровне под эгидой Международного консорциума микробиомов человека. По
результатам генетического анализа биоматериала были созданы открытые базы
данных микробиоты. Так, в открытом доступе находятся результаты исследования
таксономического состава здоровых японцев в сравнении с жителями других стран
[103].Нуклеотидные последовательности 16S рРНК многих бактерий и архей
являются общедоступными в открытых базах данных NCBI, выявленные
последовательности микроорганизмов можно сравнить с уже присутствующими в
базе данных, что помогает в идентификации.
Получаемый в результате исследования большой объём данных, благодаря
появлению современных методов статистической обработки информации, дает
этому методу высокую информативность, сделав его в настоящее время одним из
основных методов исследования состава кишечного микробиома [14], что позволяет
использовать его в качестве скринингового в клинических условиях, исключая
необходимость культивирования и клонирования микроорганизмов.
35
1.5. Влияние пищевых компонентов на конфигурацию кишечного микробиома.
Средства коррекции состава микробиома
В качестве определяющего фактора в формировании микробиома на разных
этапах жизни человека изучается роль питания. Хотя колонизация микробами
слизистых начинается с рождения, состав и конфигурация микробиома постоянно
меняется до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное состояние, которое по
составу ближе к микробиому взрослых [80].
Влияние различных видов пищевых компонентов на микробиом и связанные с
этим физиологические изменения представлены в таблице 4 [95].
В настоящий момент фармакологами разработано большое количество
микроэкологических средств для коррекции состава микробиома. Среди них можно
выделить:
- пробиотики — это живые микроорганизмы, приносящие пользу хозяину при
введении в адекватных количествах [67]. С этой целью чаще всего используются
видыLactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces boulardii и некоторые виды E. Coli
и Bacillus с доказанным эффектом [35].
- пребиотики — к ним относятся ферментированные ингредиенты, которые
образуются при специфичных изменениях в составе кишечной микробиоты и
оказывают положительный эффект на состояние здоровья хозяина/ стимулируют
рост нормального микробиома кишечника. В эту группу выделяют - олигофруктозу,
инулин, галактоолигосахариды, лактулозу, олигосахариды грудного молока. В
качестве потенциальных пребиотиков изучаются: резистентный крахмал,
конъюгированная линолевая кислота и полифенолы.
- синбиотики — в эту группу включены препараты, сочетающие в себе
функцию пробиотиков и пребиотиков. Среди них отдельно выделяются комбиотики
36
Таблица 4 – Влияние различных видов пищевых компонентов на состав микробиома
Пищевая
составляющая
Влияние на микробиом
Метаболические изменения
Белки растительного
происхождения
Увеличение количества
Lactobacillus и Bbifidobacterium
- производство лактата, который
является субстратом для синтеза
КЖК
- синтез аминокислот, витаминов
группы В, ацетата
- сдерживают рост патогенной
флоры, повышая уровень
кислотности в кишечнике
- активизируют синтез
иммуноглобулинов
- участвуют в метаболизме
глютена
- снижают риск аллергических
реакций и контролируют
воспаление
Белки животного
происхождения
Повышение Bacteroides и
Alistipes
- производят КЖК и
нейротрансмиттеры (ГАМК)
Орехи, кокосы, бобовые,
томаты, кофейные зерна
и злаки (пищевые
маннаны и
арабиноксиланы)
Увеличение Roseburia
- синтез бутирата
Цельные злаки, бурый
рис
Увеличение Eubacterium
-синтез большей части масляной
кислоты. Используют
резистентный крахмал после
первоначальной деградации его
Ruminococcusbromi
Цельнозерновые злаки,
отруби, овсяная крупа
Содержат 1,4 и 1,3-бета-
глюканы, которые являются
субстратом для Bifidobacterium,
Lactobacillus, а также основным
субстратом для Firmicutes и
Faecalibacterium
- синтез масляной кислоты
- активация
противовоспалительных
цитокинов и снижение выработки
провоспалительных
Резистентный
(устойчивый) крахмал:
зеленые бананы, манго,
бобовые, семена,
зерновой хлеб, а также
остывшие после
приготовления рис, паста
и картофель
Основной субстрат для питания
и роста бактерий из кластера
Bifidobacterium,
Faecalibacterium, Eubacterium и
Ruminococcus
После остывания структура
крахмала меняется – он проявляет
свойства как растворимого, так и
нерастворимого волокна –
субстрат для бактериального
метаболизма
- снижает pH в кишечнике
37
Продолжение таблицы 4.
Пищевая
составляющая
Влияние на микробиом
Метаболические изменения
Биоактивные
полифенолы:
фрукты, овощи, зеленый
чай, горький шоколад
Подавление роста патогенных
Clostridium, Bacteroides,
Helicobacter pylori,
Staphylococcussp.
Рост потенциальных полезных
видов Lactobacillus
и Bifidobacterium
Модуляция микробного
разнообразия и соотношения
Firmicutes и Bacteroidetes
- антиоксидантное, антимикробное
и противовоспалительное действие
Груши, яблоки,
топинамбур, бананы, лук,
спаржа, чеснок, пшеница,
зеленый горошек
(источники инулина)
Мощный пребиотик,
увеличение Faecalibacterium,
Lactobacillus и Bifidobacterium
- синтез масляной кислоты
- защита кишечника от патогенной
микрофлоры
- повышение кислотности среды,
что улучшает всасывание кальция
и магния
Высокое потребление
белков и углеводов
Снижение микробного
разнообразия, количества
Eubacterium и Roseburia
- увеличение продукции
воспалительных и уменьшение
противовоспалительных
цитокинов.
- чрезмерный рост адгезивных и
инвазивных бактерий
Насыщенные жиры
Снижение Eubacterium и
Bbifidobacterium
- риск воспалительных процессов,
метаболических нарушений,
повышение резистентности к
инсулину
Ненасыщенные жиры
Увеличение Eubacterium,
Roseburia, Ruminococcus
- уменьшение продукции
воспалительных цитокинов, как
следствие улучшение течения
аллергических процессов, в т. ч.
астмы
- препараты синбиотиков, дополнительно обогащенные витаминно-
минеральными добавками [30].
- метабиотики — продукты метаболической активности микроорганизмов,
способные участвовать в физиологических процессах [43].
Также к средствам коррекции состава микробиома относится трансплантация
фекальной микробиоты (введение фекального материала, включающего живые
38
микроорганизмы и их фрагменты, а также вырабатываемые ими активные
биологические вещества, имеющие регуляторные функции, от здорового донора, в
ЖКТ другого человека с целью восстановления кишечного микробиома). Методика,
имеющая быструю популяризацию за рубежом, и активно развивающаяся в РФ, в
частности, при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как болезнь Крона и
язвенный колит [7, 107].
Используемые в качестве пробиотиков микроорганизмы должны сохранять
свою активность при прохождении через различные отделы кишечного тракта, иметь
высокий профиль безопасности и доказанный эффект.
Эффекты пробиотиков в респираторном тракте штамм специфичны и
включают подавление роста патогенов, стимуляцию фагоцитоза, усиление
производства антиген специфических антител IgG и IgА, подавление пролиферации
мононуклеарных клеток во время воспаления, повышение уровней ИНФ-γ, ИЛ-6,
ИЛ-4, ФНО-α и ИЛ-10 (противовоспалительные цитокины) [98].
Lactobacillus наиболее широко применяемы в медицинской практике в
качестве пробиотических микроорганизмов. По данным некоторых авторов,
Limosilactobacillus reuteri активируют провоспалительные цитокины и цитокины
Th1-клеток, а B. bifidum/infantis и L. lactis снижают уровень цитокинов Th-2 и
значительно активируют продукцию ИЛ-10, что свидетельствует о
противовоспалительном действии пробиотиков [97].
По данным некоторых исследователей, возможность модифицировать
колонизацию кишечника с помощью пробиотических добавок в детстве может
предотвратить атопические заболевания во взрослом возрасте [81].
Исследование, в котором приняли участие 570 детей младшего возраста,
показало, что ежедневный прием Lacticaseibacillus rhamnosus GG в виде
сапплементации молочного продукта в течение 7 месяцев продемонстрировал
39
снижение у участников частоты ОРВИ на 17%, острых отитов на 21% и
необходимости применения антибактериальных препаратов на 19% [61].
Полученные данные использования мультиштаммовых пробиотиков в
сочетании с пребиотиками показывают, что сочетанный эффект оказывается более
значимым и длительным, в особенности для неспецифической иммунной защиты
[76].
В двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании 122 добровольца
принимали витаминно-минеральные комплексы, обогащенные пробиотиками
Lactobacillus gasseri PA штамм 16/8, Bifidobacterium longum SP 07/3 и B. Bifidum MF
20/5 в течение 3 месяцев осенне-зимнего периода, что в результате сократило
частоту и длительность эпизодов ОРВИ, отмечалось более легкое клиническое
течение эпизодов [60].
40
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объем исследования
Исследование открытое сравнительное проспективное. Проводилось с мая
2021 по ноябрь 2022 года на базе частного медицинского центра ООО «Центр
Современной Педиатрии» (ЕГРЮЛ №36003930319 от 04.07.2013 года).
В ходе исследования было обследовано 90 детей в возрасте от 1 до 6 лет, из
них мальчики составили 51% (46 человек), девочки – 49% (44 человека). Средний
возраст участников исследования составил – 3,9±1,9 лет.
Клинические исследования проведены с учетом требований Положения «О
юридических и этических принципах медико-биологических исследований у
человека». Структура исследования представлена в таблице 5.
Таблица 5 – Структура проведенного исследования
Контрольная
группа, «условно
здоровые» дети
Группа сравнения,
дети с РРИ
Основная группа, дети с РРИ
возраст 3,9±1,9 лет
n=18 муж, n=12 жен
n=27 муж, n= 33 жен
n = 15
n = 15
ОГ
1
, n = 20
ОГ
2
, n = 20
ОГ
3
, n = 20
общеклиническое обследование, генетическое секвенирование V3-V4 гена 16S-р-РНК
определение суммарного иммуноглобулина А, риноцитограмма
Патогенетически обоснованный курс профилактики
Стандартная
профилактика
ОРВИ
Стандартная
профилактика ОРВИ
+ коррекция
питания (диета)
+ курсовой
прием
биопрепаратов
+ диета и
прием
биопрепаратов
Клиническая оценка эффективности
повторное общеклиническое обследование, ОАК, ОАМ
повторное генетическое секвенирование V3-V4 гена 16S-р-РНК
определение суммарного иммуноглобулина А, риноцитограмма
Анализ полученных данных. Сравнительная оценка эффективности. Разработка
персонифицированного алгоритма профилактики РРИ
всего в исследовании – 90 пациентов
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана