Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ
ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ –
МВА имени К. И. СКРЯБИНА»
_____________________________________________
Н. Л. Еремеев, Ю. И. Блохин
ПРИКЛАДНАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ
Учебное пособие
Москва
2024
УДК 577.16(075.8)
ББК 28.072.534я73
Еремеев Н. Л. Прикладная энзимология: учебное пособие / Н. Л.
Еремеев, Ю. И. Блохин. – Москва: ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА
имени К. И. Скрябина, 2024. – 180 с. – Текст: непосредственный.
ISBN 978-5-86341-589-5
Пособие предназначено для студентов, обучающихся по направлениям подготовки: 06.03.01– Биология и 19.03.01– Биотехнология, а также может быть рекомендовано для слушателей ФПК.
В учебном пособии рассматриваются ферменты в качестве молекул, обладающих каталитической функцией, и различные варианты
их практического применения. В первой части пособия рассмотрены
вопросы эффективности и специфичности действия ферментов, принципы их международной классификации, структурная организация
белковых молекул и небелковые компоненты этих биокатализаторов.
Вторая часть посвящена методам выделения, очистки и физико
химической характеризации ферментов. В третьей части рассматривается гомогенная кинетика ферментативных реакций. Четвертая
часть посвящена промышленному применению ферментов. Получение различных продуктов иллюстрируется на примере липаз, при
описании аналитических применений подчеркиваются экологически
важные аспекты методик. Там же приведены методы получения иммобилизованных ферментов для их многократного использования в
промышленности и
функционирования гетерогенных биокаталитических систем. Заключительная часть посвящена ветеринарно-медицинским аспектам энзимологии – энзимопатологии, энзимодиагностике и энзимотерапии.
анализе, а так же кинетические особенности
Рецензенты:
Н. Л. Клячко, доктор химических наук, профессор, заведую-
щий кафедрой химической энзимологии Химического факультета
МГУ им. М. В. Ломоносова;
О. Б. Литвинов, доктор ветеринарных наук, профессор кафед-
ры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «МГАВМиБ – МВА
имени К. И. Скрябина».
Рассмотрено, одобрено и утверждено на учебно-методическом
совете ФГБОУ ВО МГАВМиБ
– МВА имени К. И. Скрябина
(28.02.2024 г.)
© ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К. И. Скрябина, 2024 г.
© Н. Л. Еремеев, Ю. И. Блохин, 2024 г.
-
2
Введение
Согласно определению Большой Медицинской Энциклопедии, энзимология – раздел биохимии, посвященный изучению строения, механизма каталитического действия и
молекулярной структуры ферментов.
Ферменты – биологические катализаторы белкового типа (катализатор – вещество, ускоряющее скорость химической реакции, при этом стехиометрически в ней не расходующееся) – уникальны по свойствам ускорения многих
химических превращений. Они играют ключевую роль в
поддержании функционирования (метаболизма, гомеостаза
и др.) живых организмов, что достигается за счет кинетического контроля протекающих в клетках реакций. С физикохимической точки зрения на гомеостаз именно ферменты
ответственны за подавление естественного стремления любой системы к достижению термодинамического равновесия (гибели живого организма).
В то же время интенсивное исследование ферментов позволило энзимологии выйти за относительно узкие рамки
раздела биохимии и оформиться в качестве самостоятельной области науки. В первую очередь это связано с успехами микробиологии, позволившей производить необходимые
ферменты в достаточном количестве. В настоящее время
множество разнообразных соединений получают в промышленных масштабах с использованием
иммобилизованных ферментов. Ферментация является основой для получения продуктов питания. Стиральные порошки и косметические средства для ухода за кожей и волосами с добавлением ферментов с успехом завоевывают рынок. Кормовые ферменты позволяют повышать эффективность животноводства и птицеводства. Широко применяются современные аналитические методы на основе ферментов, такие, как иммуноферментный анализ и биосенсоры.
процессов на базе
3
Именно поэтому изучение ферментов, как химических
молекул, является настолько важным. Эффективность и специфичность действия данного класса биокатализаторов неразрывно связаны с их трехмерной структурой. Необходимо
представлять себе источники получения ферментов, процедуры их выделения и методы физико-химической характеризации молекул. Определение кинетических параметров ферментативных реакций под действием тех
или иных факторов
позволяет подбирать оптимальные условия для применения
ферментов на практике. Разработка методов иммобилизации
биокатализаторов обеспечивает получение гетерогенных
препаратов, позволяющих многократно использовать катализатор и получать конечный продукт, не загрязненный ферментом, что особенно важно для пищевых и фармацевтических производств. Следует подчеркнуть важность использования знаний энзимологии в медицине при диагностике заболеваний и ферментной терапии.
Данное пособие базируется на лекциях по курсу
«Прикладная энзимология», который преподается на кафедре химии имени профессоров С. И. Афонского, А. Г. Малахова факультета биотехнологии и экологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К. И. Скрябина и соответствует программе этого курса. Оно предназначено для студентов, обучающихся по направлениям подготовки: 06.03.01 – Биология и 19.03.01– Биотехнология, а также может быть рекомендовано для слушателей ФПК. Кроме того, пособие может быть рекомендовано студентам других направлений
подготовки ВУЗов, изучающих дисциплину «Прикладная
энзимология» («Энзимология»).
4
1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ
1.1. Эффективность и специфичность действия
Каталитические функции присущи многим природным
биополимерам. Известны катализаторы на основе антител
(абзимы) и нуклеиновых кислот (ДНК- и РНК-зимы). Многие белки (не ферменты, например, сывороточный альбумин) способны катализировать некоторые гидролитические
реакции за счет наличия в их молекулах нуклеофильных
групп. Однако эти катализаторы, как
тивны и неспецифичны.
Первое уникальное свойство ферментов – их эффектив-
ность. Число молекул субстрата (вещество, трансформирующееся в ходе ферментативной реакции), превращаемых
одной молекулой фермента в секунду, может достигать величин (1÷3)х10
5
. По сравнению с реакциями, протекающи-
ми в отсутствие катализатора, скорость катализируемых
ферментами реакций может увеличиваться в 1010–1017 раз.
Такая разница означает, что в течение одной секунды в присутствии фермента трансформируется такое количество вещества, которое в его отсутствие трансформировалось бы за
сотни тысяч и миллионы лет.
Чем объясняется такая эффективность ферментов? Для
протекания, например, обычной бимолекулярной реакции
требуется преодоление определенного энергетического
барьера, связанного с отталкиванием электронных оболочек
реагирующих веществ (рис. 1.1). Ферментативная же реакция как правило многостадийный процесс, в котором на
первой стадии образуется комплекс между ферментом и
субстратом. В первом приближении образование в ферментсубстратном комплексе набора ионных, водородных и гидрофобных связей снижает энергию образования переходного состояния, т. е. понижает энергетический барьер реакции
и приводит к увеличению ее скорости.
правило, слабоэффек-
5
X + Y
[X...Y]
[E...X...Y]
E
[E...X]
Рис. 1.1. Диаграмма изменений стандартной свободной энергии по
координате реакции
продукты
(Е + продукты)
Второе уникальное свойство биокатализаторов – их специфичность по отношению к субстрату, например, глюкозооксидазы к -D-глюкозе, (рис. 1.2). Уреаза катализирует
гидролиз мочевины, но не активна по отношению к другим
амидным связям, в том числе пептидным. Бутандиолдегидрогеназа катализирует окисление 2,3-бутандиола в ацетоин
(3-гидрокси-2-бутанон), но совершенно не окисляет этиленгликоль, глицерин, этанол и бутанол. Более того, окисление оптических изомеров 2,3-бутандиола происходит под
действием разных ферментов – D(-) и L(+)-бутандиолдегидрогеназ, соответственно. Пептидазы и протеиназы, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах,
также активны только по отношению к L-формам аминокислот, и абсолютно нейтральны по отношению к их Dформам.
Специфичность ферментов в первую очередь определяется их третичной (четвертичной) структурой. Пространственное строение сорбционных центров ферментов таково,
что лишь максимально подходящий по структуре субстрат
способен образовывать полный набор необходимых слабых
взаимодействий в промежуточном фермент-субстратном
6
комплексе (аналогия «ключ-замок»). Любое изменение
структуры субстрата приводит к образованию энергетически «неполноценного» фермент-субстратного комплекса
(или препятствует его образованию), что приводит к невозможности последующего каталитического акта.
Рис. 1.2. Специфичность действия ферментов
на примере глюкозооксидазы
7
1.2. Классификация ферментов
В зависимости от типа катализируемой реакции ферменты разделяют на 7 классов:
1. Оксидоредуктазы. Катализируют окислительновосстановительные реакции. Субстрат, подвергающийся
окислению, рассматривается как донор водорода.
2. Трансферазы. Переносят ту или иную группу (например, метильную или гликозильную) с одного вещества
(донора) на другое (акцептор).
3. Гидролазы. Катализируют гидролитическое расщепление химических связей (акцептор – вода).
4. Лиазы. Осуществляют отщепление группы негидро-
литическим путем с образованием двойной связи или, наоборот, присоединение групп по двойным связям.
5. Изомеразы. Катализируют геометрические или
структурные (изомерные) изменения в пределах одной молекулы.
6. Лигазы (синтетазы). Осуществляют соединение (конденсацию) двух молекул, сопряженное с гидролизом фосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.
7. Транслоказы. Катализируют перенос веществ через
клеточную мембрану, связанное с дополнительной ферментативной реакцией1.
Кодовый номер фермента состоит из четырех разделен-
ных точками чисел, предваряемых аббревиатурами КФ
(Классификация ферментов) на русском и EC (Enzyme classification) на английском языке соответственно (ключ к ну-
мерации и классификации ферментов приведен в Приложении 1). Схема образования кодового номера (шифра) заключается в следующем: первое число показывает, к какому из
шести основных классов принадлежит фермент; второе указывает подкласс; третье – подподкласс; четвертое – номер
1
Седьмой класс (транслоказы) был введен в классификацию ферментов
в 2018 г.
8
фермента в его подподклассе в историческом порядке обнаружения.
Для оксидоредукзтаз (ЕС 1.х.х.х) второе число в индексе
указывает группу в доноре водорода, подвергающуюся
окислению: подкласс 1.1.х.х включает ферменты, окисляющие СН-ОН группу доноров (первичные и вторичные спирты, полуацетали), подкласс 1.8.х.х – серосодержащие группы и т
. п. (всего 19) Третье число показывает тип исполь-
зуемого акцептора: 1.1.1.х – НАД(Ф)+, 1.1.2.х – цитохром,
1.1.3.х – молекулярный кислород и т. д.
Трансферазы (ЕС 2.х.х.х) делятся на 8 подклассов. Номер
подкласса (второе число шифра) обозначает переносимую
группу: 2.1.х.х – одноуглеродный остаток, 2.2.х.х – альдегидную или кето-группу и т. д
. Третье число – подподкласс,
в данном случае уточняет природу переносимой группы.
Так, подкласс 2.1.х.х подразделяется на метилтрансферазы
2.1.1.х, гидроксиметил- и формилтрансферазы 2.1.2.х.
Для гидролаз (ЕС 3.х.х.х) второе число кодового номера
шифрует природу расщепляемой связи – подкласс 3.1.х.х
включает эстеразы сложных эфиров, 3.2.х.х включает
гликозидазы и т. д
. (всего 11 подклассов). Третья цифра
уточняет природу субстрата – подкласс 3.3.х.х (действуют на
простые эфирные связи) подразделяется на подподклассы
3.3.1.х – гидролазы тиоэфиров, и 3.3.2.х – гидролазы эфиров.
Лиазы (ЕС 4.х.х.х) разделены на 7 подклассов по типу
расщепляемой связи (4.1.х.х – С-С-лиазы, 4.2.х.х – С-О-лиазы
и т. д.). Третья цифра в шифре несет информацию о природе
элиминируемой группы (например, СО2 в подподклассе
4.1.1.х или Н2О в подподклассе 4.2.1.х).
Изомеразы (ЕС 5.х.х.х) классифицируются в соответствии
с типом реакции изомеризации (5.1.х.х – рацемазы и эпимеразы, 5.2.х.х – цис-транс-изомеразы и т. д., всего 6 подклассов). Подподклассы сформированы по типу субстратов
(5.1.1.х – действуют на аминокислоты и их производные,
5.1.3.х – действуют на углеводы и их производные и т. д.).
9
Для лигаз (ЕС 6.х.х.х) второе число в номере указывает
на тип образуемой связи: 6.1.х.х для С-О связей (ферменты,
ацилирующие тРНК); 6.2.х.х для C-S связей (синтетазы
ацил-производных СоА) и т. д. (всего 5 классов). Подподклассы фигурируют только в подклассе C-N лигаз (например, 6.3.1.х – амид-синтетазы, катализирующие реакции
между кислотой и аммиаком или амином, или 6.3.2.х – пептид-синтетазы, катализирующие взаимодействие между кислотной и аминогруппами аминокислот).
У транслоказ (7.х.х.х) в настоящее время выделено 6 подклассов в соответствии с природой переносимого через мембрану вещества (7.1.х.х – перенос гидрид-иона, 7.2.х.х – перенос неорганических катионов
и т.д.). Подподклассы характеризуют тип сопряженной ферментативной реакции (7.х.1.х –
окислительно-восстановительные реакции, 7.х.2.х – гидролиз
нуклеозидтрифосфата, 7.х.3.х – гидролиз дифосфата, 7.х.4.х –
декарбоксилирование).
Следует отметить, что существующая классификация не
является застывшей формой, а постоянно дополняется, пересматривается и уточняется. С одной стороны, открываются новые ферменты. С другой стороны, происходит переклассификация известных ферментов по мере уточнения
механизмов их действия. Так, например, пиридоксальфосфат-зависимые ферменты, катализирующие реакции элиминирования из молекулы -аминокислоты, - или заместителя с последующим присоединением на место этого заместителя другой группы. В суммарной реакции образование конечного ненасыщенного продукта реакции не
происходит, поэтому формально такие ферменты могут
быть классифицированы как алкилтрансферазы (ЕС 2.5.1.х).
Однако было показано, что подобного рода замещение происходит путем двухступенчатой реакции с промежуточным
образованием присоединенной к ферменту ,- (или ,-)
непредельной аминокислоты. В соответствии с правилом,
согласно которому классификация определяется первой катализируемой ферментом промежуточной реакцией, пра-
10
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]