Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
Ментен для двухстадийной ферментативной реакции. Если
же [S]
>> KS, то величиной KS можно пренебречь, и тогда:
o
k
v
[S]E][
oo2
2
]S[
S][
o
o
'
K
S
[S]E][
k
o
oo2
S][
o
1(S][
)
'
K
S
E][
k
o2
1
S][
o
'
K
S
(3.44)
то есть при дальнейшем увеличении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции будет уменьшаться.
Кинетический анализ подобных зависимостей проводят
раздельно для низких и высоких концентраций субстрата.
Область низких концентраций, которая описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, обрабатывается, например, в
координатах Лайнуивера-Берка, что позволяет получить
значения V
и KS. При высоких концентрациях субстрата
max
(уравнение (3.44)) представление экспериментальных дан-
ных в координатах 1/v – [S]
ны V
и K’S. Совпадение значений V
max
позволяет определить величи-
o
, полученных при
max
низких и высоких концентрациях субстрата, является доказательством применимости данной схемы для формального
описания кинетики изучаемой ферментативной реакции.
Пример экспериментальных данных реакции с полным субстратным ингибированием и их обработкой приведен на рисунке 3.6.
Полная активация субстратом (k2 = 0). Уравнение
(3.41) в данном случае трансформируется к виду:
S][
o
(
k
3
'
K
v
S][
K
[S]E])[
S
oS
oo
2
]S[
o
'
K
S
k
KK
2
[S]E][
oo3
2
[S])S][('
ooSS
(3.45)
Как видно из уравнения (3.45), при насыщающих концентрациях
субстрата скорость реакции выходит на предельное значение
. Однако при низких концентрациях([S]o << KS) зависимость
V
max
61
скорости реакции от концентрации субстрата приобретает квадратичный характер. Это приводит к характерному «сигмоидальному» виду получаемых зависимостей. Наблюдаемая константа
Михаэлиса при этом зависит от концентрации субстрата, поэтому для таких случаев говорят о концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной ([S]
0,5
).
400
300
A
200
, усл. ед.
o
V
100
0 100 200 300 400 500 600
0,04
-1
0,03
0,02
, усл. ед.
o
0,01
1/V
- 1/K
S
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
1/[S]o, мкМ
-1
Б
[S]o, мкМ
- K'
0,014
-1
0,012
0,010
0,008
, усл. ед.
o
0,006
1/V
0,004
S
0,002
-200 0 200 400 600
В
[S]o, мкМ
Рис. 3.6. Зависимость скорости реакции гидролиза пирофосфата
марганца (II) неорганической пирофосфатазой E.coli от концентрации
субстрата (А) и обработка экспериментальных данных в области низких
(Б) и высоких (В) концентраций субстрата.
7
Рассчитано по: Ю. П.Вайнонен, Е. В. Родина, Н. Н. Воробьева, С. А.
Курилова, Т. И. Назарова, С. М. Аваева. Особенности гидролиза органического и неорганического субстрата неорганической пирофосфатазой Escherichia coli в присутствии различных металлов-активаторов. –
Известия Академии Наук, Сер. хим., 2001, № 10, с. 1793–1799.
62
7
Аллостерические эффекты. Исходно понятие «аллосте-
8
рический»
было введено для эффекторов, отличных по
структуре от субстрата. Предполагалось, что структурный
аналог субстрата («изостерический» эффектор) реагирует
именно по центру связывания субстрата в ферменте, в то
время как аллостерический эффектор связывается в другом
(аллостерическом) центре связывания. Возникающие в результате конформационные изменения белковой глобулы
меняют и конформацию активного центра фермента
, вызывая эффект активации или ингибирования. В настоящее
время термин «аллостерический» стали применять ко всем
ферментам, обладающим кооперативными свойствами. Под
кооперативностью при этом понимают явление, при котором взаимодействие молекулы некоторого лиганда (эффектора) с ферментом влияет на связывание последующих молекул (обычно данный эффект характерен для белков с четвертичной структурой). Различают гомотропный (влияние
лиганда на связывание того же лиганда) и гетеротропный
(влияние лиганда на связывание другого лиганда) кооперативные эффекты. Гомотропные эффекты, приводящие к
увеличению сродства фермента к присоединению последующих молекул лиганда, называют положительной коопе-
ративностью. Наоборот, отрицательной кооперативностью, или антикооперативностью, называют эффекты
ухудшения связывания последующих молекул лиганда с
ферментом
после взаимодействия белка с первой молекулой
лиганда. Следует подчеркнуть, что для всех достаточно хорошо изученных кооперативных ферментов действительно
обнаружены аллостерические эффекторы, однако фермент,
подвергающийся аллостерическому ингибированию или активации, может и не обладать кооперативными свойствами.
Рассмотренные выше случаи субстратного ингибирования
8
J. Monod, F. Jacob. Teleonomic mechanisms in cellular metabolism,
growth, and differentiation. – Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol., 1961,
v.26, p.389–401
63
(уравнение (3.44)) и активации (уравнение (3.45)) представ-
ляют собой классические случаи отрицательной и положительной кооперативности соответственно.
Субстратная активация обычно выражается в S-образной
зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.
Для описания кинетики действия таких ферментов применяют уравнение Хилла. Вывод его основан на предположении о кооперативном характере связывания нескольких мо-
субстрата с ферментом без учета промежуточных
лекул
комплексов согласно схеме:
(3.46)
Вывод самого уравнения скорости проводят аналогично
описанному выше методу для схемы (3.1), и в результате
получают:
V
v
K
omax
n
S][
o
(3.47)
n
S][
Параметр n называется коэффициентом
Хилла (в биохи-
мии он часто обозначается знаком «h») и определяют обработкой зависимости скорости реакции от концентрации субстрата методом нелинейной регрессии. Следует отметить ряд
моментов, связанных с использованием уравнения Хилла.
Во-первых, константа K (схема (3.46), уравнение (3.47)) не
имеет смысла константы Михаэлиса. Ее размерность n зависит от числа связавшихся молекул субстрата
. Во-вторых, коэффициент Хилла практически никогда не бывает целочисленным – это связано с наличием на практике промежуточных фермент-субстратных комплексов (ES
, ES2…ES
1
n-1
), ко-
торые не учитываются при выводе уравнения Хилла, но делают константу К зависимой от концентрации субстрата (см.
уравнение (3.43)).
64
Влияние обратимых эффекторов на аллостерические
ферменты выражается в изменении коэффициента Хилла на
зависимостях скорости реакции от концентрации субстратаингибиторы увеличивают его значение, а активаторы
уменьшают. Схематичное изображение влияния обратимых
эффекторов на аллостерические ферменты приведено на рисунке 3.7.
1,0
0,8
1
0,6
V
0,4
0,2
0,0
0,00,20,40,60,81,01,2
2
[S]
3
0,5
[S]
o
Рис. 3.7. Зависимость скорости реакции аллостерического фермента от
концентрации субстрата (кривая 2) и влияние на нее активатора
(кривая 1) и ингибитора (кривая 3)
Изучение механизмов действия обратимых ингибиторов и
определение констант их взаимодействия с ферментом играет важную роль в предклиническом изучении потенциальных
лекарственных препаратов. Большое количество лекарств
представляют собой ингибиторы ферментов. На практике в
качестве меры ингибирующей способности соединения используют величину [I]
. Это значение соответствует концен-
50
трации ингибитора, при которой скорость ферментативной
реакции снижается в два раза. Если рассчитать связь между
величинами [I]
и Ki, то легко увидеть, что только для не-
50
конкурентного типа ингибирования реализуется равенство
между ними: [I]
= Ki. В других случаях значение [I]50 зави-
50
сит от концентрации субстрата – для конкурентного ингиби-
65
тора с ростом концентрации субстрата эффективность ингибирования снижается, а для бесконкурентного, наоборот,
растет. Таким образом, при определении требуемой дозы лекарственного препарата на основе конкурентных или бесконкурентных ингибиторов необходимо учитывать и концентрацию эндогенного субстрата целевого фермента-мишени.
Несколько слов к вопросу о соответствии кинетического
типа ингибирования молекулярному механизму
комплексообразования эффектора с ферментом. Для простоты и образности восприятия эффектов ингибирования эти понятия
отождествляются. Так, например, при конкурентном типе
ингибирования говорят о конкуренции субстрата и эффектора (ингибитора) за связывание на сорбционном участке
активного центра фермента, а в случаях неконкурентного
типа ингибирования делается заключение о взаимодействии
ингибитора с
функциональными группами каталитического
участка активного центра фермента. Однако связывание
эффектора может происходить достаточно далеко от активного центра, но вызывать конформационные изменения в
белке, выражающиеся в изменении его активности. Такой
вариант, например, реализуется в природе для достаточно
большого количества аллостерических ферментов. Возникновение стерических затруднений для входа субстрата в
сорбционный центр
, связанных с появлением неподалеку от
него крупной молекулы, также будут проявляться в кинетическом виде конкурентного ингибирования. Именно на таком принципе основан метод гомогенного иммуноанализа
EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique), в котором
фиксируется изменении активности ферментной метки в
конъюгате фермент-антиген в результате стерического исключения доступности молекулы субстрата к активному
центру фермента при
антителами.
комплексообразовании конъюгата с
Необходимо также учитывать и тот факт, что различающиеся между собой схемы реакций могут приводить к одному и тому же кинетическому эффекту. Этот момент об-
66
суждался выше на примере бесконкурентного ингибирования при сравнении схем (3.21) и (3.32). Аналогичный пример можно привести и для полного субстратного ингибирования. Если предположить, что субстрат способен к димеризации и этот димер является конкурентным ингибитором
фермента согласно схеме:
(3.48)
то кинетический анализ в данном случае приведет к уравнению 3.44.
3.3. Инактиваторы ферментов
Инактиваторами фермента называют вещества, вызывающие потерю активности в результате образования ковалентных связей с функциональными группами активного
центра белка. В результате регенерации свободного фермента не происходит и он, как катализатор исключается «из
обращения». В простейшем случае бимолекулярной реакции схема реакции выглядит следующим образом:
(3.49)
где k
– константа скорости второго порядка. Соответствую-
ин
щее схеме (3.49) уравнение скорости записывается в виде:
67
]E[]EI[
d
dt
d
dt
k
ин
]E][I[
(3.50)
В аналитическом виде решение уравнения (3.50) имеет
сложный нелинейный вид, однако можно выделить два простых предельных случая – режим титрования числа активных центров фермента и режим псевдопервого порядка.
В режиме титрования числа активных центров фермента мы имеем избыток фермента по сравнению с ингибито-
ром. Тогда при полном протекании
реакции весь ингибитор
перейдет в фермент-ингибиторный комплекс. Из уравнения
материального баланса следует, что в этом случае:
= [EI] = [E]o – [E] (3.51)
[I]
o
Поскольку концентрация фермента прямо пропорциональна
его активности ([E]
~ [А]o, [E] ~ [А]), то зависимость оста-
o
точной активности А от исходной концентрации инактиватора [I]
представляет собой прямую линию, отсекающую
o
на оси абсцисс концентрацию активных центров фермента в
эксперименте (рис. 3.8).
Второй предельный случай необратимого ингибирования
– режим псевдопервого порядка. При большом избытке ингибитора в реакции (3.49) можно пренебречь его расходом
(то есть принять [I]
[I]o; где [I]o – начальная концентрация
t
ингибитора). Тогда уравнение (3.50) трансформируется к
виду:
]E[
d
dt
k
]E][I[
oин
(3.52)
и решение последнего:
]E[
ln(
E][
o
[I])
tktk
эффoин
(3.53)
68
A
o
Активность, А
[E]
[I]
o
o
Рис. 3.8. Определение концентрации активных центров ферментов в
режиме титрования.
Из уравнения 3.53 видно, что построение экспериментальных данных в координатах ln([А]
/[А]о) – t (поскольку
t
измеряемая ферментативная активность прямо пропорциональна концентрации свободного фермента в растворе) позволяет определить эффективные константы инактивации
(тангенсы углов наклона прямых), зависящие от концентрации инактиватора (рис. 3.9, А). Истинную константу инактивации находят при построении найденных значений эффективных констант от концентрации необратимого ингибитора в смеси как
тангенс угла наклона полученной пря-
мой (рис. 3.9, Б).
С другой стороны, при фиксированном времени (t =
const) реакции фермента с ингибитором величина
ln(A
t=const/Ao
) = -K[I]o, где K = kинt. Отсюда следует, что для
необратимых ингибиторов ферментов экспериментальные
данные возможно линеаризовать в координатах
ln(A
t=const/Ao
ный график и измеряя A
) от [I]o. Таким образом, построив калибровоч-
при инкубации фермента с не-
t=const
известной пробой, становится возможным определение
концентрации ингибитора в данной пробе. На этом принципе основаны многочисленные методики ингибиторного анализа (определение концентраций инактиваторов в образцах
69
почв, воды, пищевых продуктах, биологических жидкостях
и т. д.).
o
)
o
/A
t
ln(A
Рис. 3.9. Определение эффективных констант инактивации фермента
при различных концентрациях необратимого ингибитора (А, 1-4) и оп-
A
время
ределение истинной константы инактивации (Б)
[I]
ин
= -k
эфф
k
[I]
Б
o
3.4. Интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен
Как было показано ранее (см. раздел 3.1), уравнение Михаэлиса-Ментен в дифференциальной форме справедливо
только при условии [S] [S]
, то есть когда расходом суб-
o
страта можно пренебречь. В этом случае в эксперименте
наблюдается длительный промежуток прямой пропорциональности накопления продукта реакции (расхода субстрата) от времени (рис. 3.10, А), то есть реакция протекает в
стационарном режиме. В то же время очень часто скорость
реакции заметно уменьшается в ходе протекания, что
при-
водит к нелинейным закономерностям (рис. 3.10, Б).
Чаще всего подобный вид экспериментальных зависимостей связан с заметным расходованием субстрата, когда
дифференциальная форма уравнения Михаэлиса-Ментен
(3.16) неприменима. В противном случае его необходимо
записывать с учетом не начальных, а текущих концентраций субстрата (уравнение (3.54)).
[S]
[S]
d
v
dt
V
max
K
m
]S[
(3.54)
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]