Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
це конъюгированный фермент. После образования в лунке
дуплексов с ДНК пробы и последующей отмывки в лунку
добавляют избыток меченого ферментом олигонуклеотида.
Определение активности фермента в данной системе показывает количество оставшихся свободными исходных олигонуклеотидов, количество ДНК в пробе рассчитывают по
разности.
4.3. Методы иммобилизации ферментов
Иммобилизация фермента – это переведение биокатализатора в гетерогенную фазу по отношению к раствору субстрата. В промышленности иммобилизация позволяет пространственно разделить фермент и реагенты, что обуславливает возможность легкого отделения катализатора от реакционной смеси. Таким образом, продукт не содержит
примесей фермента, а сам иммобилизованный препарат
может быть многократно
использован в циклах биотехнологического процесса. В аналитических процедурах с использованием ферментов широко используются биосенсоры –
приборы, где фермент «закреплен» на поверхности преобразователя (оптического, электрохимического и т. д.),
трансформирующего изменение концентраций веществ в
ходе ферментативной реакции в электрический сигнал, отображаемый электроникой. Таким образом, методы получения иммобилизованных ферментов
является важной частью
промышленного применения ферментов.
Можно выделить три базовых способа получения препарата иммобилизованного фермента: физическое включение,
адсорбция и ковалентная иммобилизация, которые различаются по энергии взаимодействия между молекулой белка
и носителем (рис. 4.1).
101
А Б
В Г
Рис. 4.1. Методы иммобилизации ферментов: (А) – включение в кон-
тейнер; (Б) – включение в гель; (В) – сорбция в объеме и/или на по-
верхности носителя; (Г) – ковалентное связывание в объеме и/или на
поверхности носителя
Физическое включение в контейнеры (рис. 4.1, А), или гели
(рис. 4.1, Б), не подразумевает какого-либо взаимодействия
компонентов системы. Фермент удерживается носителем за
счет стерических факторов – непроницаемой для белка оболочкой контейнера или порами матрицы геля, препятствующих ввиду своих малых размеров выходу крупных молекул белка в раствор. Иммобилизация адсорбцией (рис
102
. 4.1,
В) основана на слабых (электростатических, гидрофобных и
т. п.) взаимодействиях ферментов и носителя. И, наконец,
получение препаратов образованием химической связи между матрицей и белком, называют ковалентной иммобили-
зацией
(рис. 4.1, Г). Рассмотрим более подробно указанные
выше способы.
4.3.1. Физическое включение
Включение в контейнеры. В зависимости от технологии
получения, контейнеры с полупроницаемой оболочкой могут
иметь различные размеры. Так, при микрокапсулировании их
размер колеблется от десятков до сотен микрометров. Суть
этого метода заключается в создании эмульсии водного раствора фермента в несмешивающемся с водой органическом
растворителе – размеры получаемых контейнеров определяются размерами водных капель. Полимерная
оболочка образуется, например, в результате межфазной поликонденсации
диамина, вводимого в водную фазу, и дихлорангидрида, вводимого в органическую фазу (чаще всего используют пару
гексаметилендиамин-себацилхлорид). Небольшая часть белка участвует своими свободными аминогруппами, поперечно
сшивая линейные нити образующегося найлонового полимера и упрочняя тем самым мембрану. При диаметре пор
оболочки
менее 10 нм толщина стенок таких микрокапсул
составляет не более 100 нм, что обуславливает их не очень
высокую механическую прочность. Более толстые стенки
микрокапсул (сотни нанометров) могут быть получены методом межфазной коацервации, когда водный раствор фермента эмульгируют в органическом растворе уже готового
нерастворимого в воде полимера. Полупроницаемая оболочка в
данном случае образуется за счет осаждения органорастворимого полимера на границе раздела фаз вода/органический растворитель – наиболее часто для этого
используют различные производные целлюлозы (этилцеллюлоза, нитроцеллюлоза и т. д.). Наиболее толстые оболоч-
103
ки (до микрометра) получают методом двойного эмульгиро-
вания. Здесь вначале готовят водную эмульсию раствора
фермента в органическом растворе полимера, как и в предыдущем случае. Готовую эмульсию вновь диспергируют в
воде. В результате получают водную эмульсию из капель
органического раствора полимера, содержащих внутри себя
капли исходного водного раствора фермента. Через опреде
ленное время органический слой затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с включенным в них белком.
Данный метод позволяет широко варьировать свойства
мембраны микрокапсул, используя различные пленкообразующие полимеры (полифенилсиоксаны, полистирол, поливинилхлорид, поликарбонаты и т. д.).
Липосомы представляют собой сферические контейнеры
размерами 50–1000 нм, внутренний объем которых изолирован от внешнего
раствора одним или несколькими липидными бислoями. Молекулы липидов в бислое ориентированы
таким образом, что их полярные «головы» обращены наружу
(в сторону водной фазы), а гидрофобные цепочки жирных
кислот обращены внутрь и ориентированы практически параллельно друг другу. Размеры и физико-химические свойства липосом определяются методом их получения
и природой
используемых липидов. Например, при диспергировании
раствора липида в органическом растворителе в водном растворе фермента и отгонке растворителя в токе инертного газа
происходит самопроизвольное образование бислойных фермент-содержащих липосом размерами до 200 нм. В другом
варианте раствор фермента вносят в колбу, на стенках которой имеется тонкая пленка липида
(саму пленку получают
упариванием раствор липида в органическом растворителе),
встряхивают и выдерживают в течение некоторого времени.
В данном случае происходит самосборка крупных мультиламеллярных липосом. Для приготовления липосом наиболее
часто используются фосфолипиды (фосфатидилхолин, кардиолипин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), холестерин, смеси липидов.
104
-
В тройных системах вода/синтетическое поверхностноактивное вещество (ПАВ)/несмешивающийся с водой органический растворитель в зависимости от соотношения компонентов могут реализовываться различные способы упаковки молекул ПАВ. Одним из вариантов упаковки (при
малом содержании воды) являются обращенные мицеллы –
наноразмерная (1–100 нм) эмульсия воды в масле. Молекулы ПАВ в данном
случае образуют оболочку водной среды,
располагаясь гидрофильными группами в водную фазу, а
гидрофобными – в органический растворитель. Образование такой надмолекулярной структуры происходит спонтанно и быстро (от секунд до нескольких минут при простом встряхивании смеси), при этом если белок растворен в
водной фазе, то он автоматически включается во внутреннюю полость мицеллы. Получаемые агрегаты имеют высокую степень структурированности (минимальные различия
в диаметре, молекулярном весе агрегатов или в плотности
упаковки) и являются термодинамически стабильными (не
меняют свои геометрические характеристики в течение довольно долгого времени). Размер обращенных мицелл легко
контролируется исходным составом реакционной смеси –
достаточно менять соотношение концентраций ПАВ и
воды
в органическом растворителе. Увеличение концентрации
ПАВ в системе приводит к уменьшению размеров мицелл,
увеличение концентрации воды влечет за собой увеличение
размеров внутренней полости мицеллы. В качестве органических растворителей в подобных системах можно использовать углеводороды (например, октан или бензол), высшие
спирты, хлороформ и т. д. В качестве ПАВ
применяют различные производные типа Brij, Tween или Triton или натуральные фосфолипиды (индивидуально или в смесях).
Избежать использования органических растворителей
при формировании контейнеров позволяет техника формирования полиэлектролитных капсул при помощи послойной
адсорбции полиэлектролитов (в англоязычной литературе
«layer-by-layer»). В основе метода лежит электростатиче-
105
ское взаимодействие заряженной подложки с противоположно заряженными цепями полимера, которое достигается
погружением подложки в раствор полиэлектролита.
Первая стадия адсорбции приводит к образованию монослоя полимера и перезарядке поверхности. После промывания и удаления избытка первого полиэлектролита подложку погружают в раствор противоположно заряженного полиэлектролита, что приводит к формированию второго
полиэлектролитного слоя и новой перезарядке поверхности.
Чередующаяся многократная адсорбция обеспечивает образование стабильных полиэлектролитных мультислоев с различными свойствами, которые определяются порядком нанесения слоев и их числом, а также природой используемых
синтетических и природных полимеров. Формирование подобных конструкций на сферических микро- и наночастицах с последующим растворением
твердого ядра приводит к
образованию полых капсул, толщина полиэлектролитной
оболочки которых (от 1 до 100 нм) зависит от числа нанесенных полимерных слоев. Ферменты вводят в систему на
стадии образования ядра – особую популярность в последнее время приобрел ватерит, полиморфная модификация
15
карбоната кальция
. Сферические микрочастицы ватерита
образуются при простом смешении солей хлорида кальция
и карбоната натрия и эффективно включают в себя имеющиеся в растворе белки. После образования полиэлектролитной оболочки ватеритное ядро легко растворяется в результате подкисления раствора ниже рН 7.0 или добавления
этилендиаминтетрауксусной кислоты. В качестве полиэлектролитов наиболее часто используют
синтетические полистиролсульфонат и полиаллиамин, а также природные декстрансульфат и хитозан.
15
Н. Г. Балабушевич. Микрокапсулирование белков с использованием
наноструктурированных гибридных матриц и послойной адсорбции
полиэлектролитов. – Дисс. д. хим. наук, Москва, 2022.
106
Включение в гели. Принцип данного подхода состоит в
том, что молекулы фермента включаются в матрицу из полимерных цепей (гель). Размеры пор геля меньше размеров
молекулы белка, ввиду чего он не может покинуть носитель.
Для получения подобных препаратов иммобилизованных
ферментов используют два основных метода – образование
полимерной сетки из мономеров и гелеобразование готовых
полимеров.
При радикальной полимеризации фермент помещают в
водный раствор мономера, содержащего двойную связь, и
проводят полимеризацию. Чаще всего в качестве мономера
применяют акриламид и его различные производные (акриловая кислота, метакриловая кислота, метилметакрилат и
т. д.) – в этом случае получаемые в результате полимеризации гели содержат до 90 % воды, то есть практически не
влияют на микроокружение молекулы иммобилизованного
фермента. Можно отметить также и другие мономеры, используемые для этой цели, например, винилкапролактам, 2этил-N-винилимидазол и т. д. При этом для успешного
формирования трехмерной сетки необходимо наличие в реакционной смеси некоторого количества бифункционального (содержащего в молекуле две двойные связи) агента, который
обеспечивает сшивание полимерных цепей между
собой. В то же время золь-гель технология – поликонденсация монокремниевой кислоты Si(OH)
в поликремниевую –
4
не требует наличия сшивающего агента. Золь кремниевой
кислоты, полученный гидролизом кремнийорганического
соединения (чаще всего тетраметоксисилана), в течение нескольких часов самопроизвольно формирует гель, представляющий собой трехмерную сетку из атомов кремния,
соединенных кислородными мостиками (силикагель). В настоящее время изучаются также возможности использования по аналогичной технологии гелей
на основе циркония.
Гидрофильные полимерные сетки могут быть получены и
при использовании уже готовых полимеров. Так, ряд природных (например, агар-агар и желатин) и синтетических
107
(поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль) полимеров об-
ладают свойством гелеобразования при охлаждении их горячих водных растворов. Раствор фермента вводят при температуре начала гелеобразования, в результате при дальнейшем
охлаждении образуется гель, содержащий фермент. Техника
ионного сшивания применяется при иммобилизации ферментов в альгинатные гели. Полимерные цепи альгината (природный линейный полисахарид
из бурых водорослей, состо-
ит из соединенных -1,4-гликозидными связями остатков D-маннуроната и -L-гулуроната) взаимодействуют между
собой за счет мостиковых электростатических взаимодействий с двухвалентными катионами – на практике чаще всего
используют ионы кальция. Ковалентное сшивание
полимер-
ных цепей в гелеобразную сетку можно проиллюстрировать
иммобилизацией ферментов в фотополимеризующиеся смолы – растворимые полимеры, содержащие функциональные
светочувствительные группы. Раствор такого полимера и
фермента облучают светом (обычно в ультрафиолетовом
диапазоне), активированные фоточувствительные группы
образуют между собой ковалентные связи, что и приводит к
образованию трехмерной полимерной сетки.
Следует отметить, что при
любом варианте включения
ферментов в гели конечным продуктом является гелевый
блок. Для применения в технологическом процессе этот продукт необходимо механически измельчить. Однако проведение процедуры иммобилизации в описанных выше эмульсиях воды в органическом растворителе или системе обращенных мицелл позволяет получать препарат иммобилизованного фермента в виде сферических
частиц, размер которых оп-
ределяется размером водных капель в исходной системе.
4.3.2. Адсорбция
Иммобилизация адсорбцией является наиболее простым
способом получения иммобилизованных препаратов ферментов с методической точки зрения. Суспензия носителя в
108
водном растворе биокатализатора перемешивается в течение времени, требующегося для установления равновесия
между свободным и адсорбированным ферментом. Далее
следует стадия отмывки от несвязавшегося белка и препарат
готов к использованию.
Сорбция фермента на носителе обеспечивается слабыми
взаимодействиями – в большинстве случаев используются
электростатические взаимодействия и водородные связи
между носителем и заряженными поверхностными группа
ми белка. Спектр носителей в этом случае весьма широк. Из
неорганических носителей можно отметить оксиды металлов (алюминия, титана, железа и т. д.), нерастворимые в воде соли (например, фосфат и карбонат кальция), силикагель,
пористое стекло, керамику. Для удешевления конечной
стоимости иммобилизованного препарата в качестве носителей применяют природные минералы,
такие, как кремнезем, диатомит, кизельгур, гидроксилапатит, алюмосиликаты
(глины). Среди органических носителей наибольшее распространение имеют различные полисахариды и ионообменные смолы.
В ряде случаев более целесообразно использовать гидрофобные взаимодействия носителя и белка. Так, естественные субстраты липаз – жиры и масла – практически нерастворимы в воде и присутствуют в
природе в виде эмульсий. В этой связи белковые глобулы липаз имеют весьма
обширные гидрофобные области, позволяющие ферменту
сорбироваться на каплях органической эмульсии и эффективно гидролизовать субстрат. Гидрофобизация поверхности пористого стекла показала прямую пропорциональность
между количеством адсорбированного фермента и контактным углом воды на этой поверхности. А сорбция липаз
на
полистирол является практически необратимой.
Наконец, можно отметить и использование координаци-
онных взаимодействий для получения препаратов иммобилизованных ферментов. Как отмечалось выше, в рекомбинантные белки зачастую вводят His-tag для упрощения их
109
-
очистки с помощью металло-хелатной хроматографии (см.
раздел 2.2). Именно сорбенты для металло-хелатной хроматографии предлагаются в качестве носителей для иммобилизации рекомбинантных биокатализаторов.
Основным недостатком адсорбционной иммобилизации
ферментов является то, что адсорбция – это равновесный
процесс. В растворе всегда устанавливается равновесие между адсорбированным и растворенным ферментом, которое
определяется равновесной константой
десорбции. Иными
словами говоря, при каждом цикле использования препарата иммобилизованного адсорбцией фермента какая-то часть
белка будет выходить в реакционный раствор, что приводит
как к загрязнению конечного продукта, так и уменьшению
активности самого препарата. Однако данные недостатки не
всегда перевешивают достоинства данного метода – простота методик получения иммобилизованного фермента
и де-
шевизна сорбентов, выступающих в роли носителей.
4.3.3. Ковалентная иммобилизация
Методы ковалентной иммобилизации ферментов в каждом конкретном случае определяются химической природой
реакционно-способных группировок носителя и белка. Боковые радикалы многих протеиногенных аминокислот содержат функциональные группы, которые дают возможность образования ковалентной связи с теми или иными
химическими агентами. В их числе тиольные (цистеин),
карбоксильные (глутаминовая и аспарагиновая
кислоты,
С-концевая), гидроксильные (серин, треонин и тирозин),
гуанидиновые (аргинин), имидазольные (гистидин) и аминогруппы (лизин, N-концевая). Носитель же предварительно модифицируют таким образом, чтобы условия реакции
иммобилизации были по возможности мягкими и не вызывали сильной денатурации белка.
Исходно активированные носители по типу взаимодейст-
вия с белками можно условно разделить
110
на специфические
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]