Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
(реагирующие только с конкретными функциональными
группами белка) и неспецифические (образующие ковалентную связь с широким набором белковых группировок). К
наиболее неспецифическим носителям относятся полимеры,
модифицированные арилазидными остатками. При фотохимическом распаде таких соединений под действием УФсвета выделяется молекула азота и образуются нитреновые
радикалы, реагирующие практически с любой химической
связью
по нижеприведенной схеме:
Проблемой использования таких носителей является необходимость достаточно плотного контакта белка и полимера, то есть проведение фотохимической реакции в высушенном состоянии реакционной смеси – в противном случае образующиеся радикалы буду предпочтительно взаимодействовать с молекулами растворителя. Кроме того, жесткое облучение ферментов вызывает их необратимую инактивацию.
Носители
, содержащие концевые алифатические эпоксидные группировки, эффективно связываются с тио-, амино- и
гидроксильными группами белков по следующей схеме:
В зависимости от рН среды подобное алкилирование
можно направить преимущественно на амино- или на окси-
111
группы. По аналогичному механизму с белками взаимодействуют носители, модифицированные концевыми иминоили тиооксидными группировками.
К неспецифическим методам иммобилизации ферментов
следует отнести и активацию носителей хлористым циануром (2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин). Замещение атомов хлора
в этом соединении происходит в присутствии соединений с
HО-, HS- или H
N-группами по следующей схеме:
2
Удобным является то, что первый атом хлора эффектив-
о
но реагирует при температурах 0–10
о
С (третий атом, реагирующий при 80–100 оС, при иммо-
50
С, а второй – при 20–
билизации ферментов не используется). Такое различие в
реакционной способности атомов хлора позволяет разделять стадии модификации носителя и связывания белка.
Специфические методы иммобилизации используют химические реакции, нацеленные на конкретные функциональные группировки, например, на аминогруппы остатков
лизина. Так, наиболее простым способом фиксирования
белка на носителе является образование
азометиновых связей (оснований Шиффа) в реакции конденсации амино- и
альдегидсодержащих соединений согласно схемы:
112
В щелочных средах (pH > 8) эта реакция протекает количественно и достаточно быстро, однако в кислых условиях
(рН < 6) основания Шиффа гидролизуются до исходных
веществ. В этой связи на практике используется последующее восстановление азометиновой связи до устойчивого
вторичного амина (чаще всего для этой цели применяют
боргидрид натрия) по следующей схеме:
Весьма простым способом получения альдегидсодержащих носителей является перйодатное окисление природных
полисахаридов (целлюлоза и ее производные, декстраны и
т. д., для примера на схеме приведено окисление -Dглюкозы):
Подобному же окислению может быть подвергнут углеводный фрагмент гликопротеина (многие ферменты гликозилированы), после чего по аналогичной схеме белок фиксируется на матрице, содержащей аминогруппы.
Для введения альдегидных групп в аминосодержащие
носители применяют диальдегиды (обычно глутаровый альдегид СНО-(СН
-СНО). Реакция диальдегида с матрицей
2)3
переводит аминогруппы носителя в альдегидные, на второй
113
стадии к активированному носителю добавляют белок. Таким образом, диальдегид представляет собой мостик между
аминогруппами матрицы и белка.
Однако тот же самый глутаровый альдегид способен
также сшивать аминогруппы между молекулами белка. Этот
принцип положен в основу получения так называемых иммобилизованных препаратов ферментов без носителя – поперечно-сшитых агрегатов ферментов (cross-linked enzyme
aggregates, CLEAs).
Высоленные высокой ионной силой или
добавлением органического растворителя белки обрабатывают глутаровым альдегидом с получением нерастворимых
иммобилизованных ферментных препаратов в отсутствие
матрицы.
Активация бромцианом различных полиолов (как синтетических полимеров, так и природных полисахаридов в
первую очередь) широко применяется на практике. При
взаимодействии бромциана с гидроксильными группами
носителя через исходные цианаты
образуются имидокарбонатные группы (побочная реакция гидролиза дает неактивный карбамат).
Реакция цианатов и имидокарбонатов с -аминогруппами
лизина белка фиксирует фермент на матрице как производное изомочевины или N-замещенного карбамата:
114
Хлорангидриды карбоновых кислот эффективно ацилируют аминогруппы белков при рН > 7, однако весьма быстро гидролизуются в этих условиях. Тем не менее, они применяются для исходной модификации белка, то есть для
введения на поверхность глобулы заместителей. В частности, модификация фермента акрилоилхлоридом позволяет
получать препарат белка, содержащий в своей структуре
двойные
связи. При радикальной полимеризации такие белки не просто включаются в образующийся гель, а ковалентно включаются в него, выступая при этом в качестве дополнительного бифунционального сшивающего агента:
Классический способ пептидного синтеза (образования
пептидной связи) заключается в активации карбоксильных
групп карбодиимидами. На первой стадии образуется производное О-ацилизомочевины:
На второй стадии происходит взаимодействие с аминокомпонентой:
115
Другой вариант активации карбоксильных групп для
пептидного синтеза с использованием изоксазолиевых солей был предложен Р. Вудвордом (широко известен реактив
Вудворда – N-этил-5-фенилизоксазолий-3’-сульфонат). Реактив Вудворда вступает в реакцию с карбоксильной группой по следующей схеме:
Полученный сложный енольный эфир эффективно реагирует с аминокомпонентой, образуя пептидную (амидную)
связь:
Как видно из приведенных выше схем, как карбодиимиды, так и изоксазилиевые соли выступают в качестве конденсирующих агентов между карбоксильными и аминогруппами. Таким образом, активация карбоксильных групп
ферментов этими соединениями приводит к образованию
белковых внутри- и межмолекулярных связей. В этой связи
такие методы применяются для предварительной активации
носителей
с поверхностными карбоксильными группами с
последующей иммобилизации белков.
Наконец, сульфгидрильные (тиольные) группы остатков
цистеина в присутствии тиол-содержащих носителей спонтанно окисляются растворенным в воде кислородом, образуя дисульфидные связи:
116
Конечно, свободные сульфгидрильные группы в белках
встречаются достаточно редко – в основном остатки цистеина задействованы в поддержании третичной структуры
через образующиеся дисульфидные мостики. Однако перед
иммобилизацией фермента есть возможность восстановить
его дисульфидные связи подходящим восстановителем
(меркаптоэтанол, дитиотрейтол и т. д.). При этом реокисление тиольных групп по окончании иммобилизации
может
приводить к образованию «неправильных» дисульфидных
мостиков в белке, что сопровождается потерей каталитической активности иммобилизованного фермента. С другой
стороны, на поверхность белка можно предварительно ввести дополнительные SH-группы ацилированием его аминогрупп реагентами, содержащими защищенную сульфгидрильную группу (например, тиолактоном гомоцистеина).
4.4. Особенности кинетического поведения
иммобилизованных ферментов
В гетерогенно-каталитических системах массообмен между раствором субстрата и иммобилизованным биокатализатором играет важную роль. Массоперенос в любой среде совершается за счет двух различных процессов – конвекции (перемешивания) и молекулярной диффузии (направленный перенос вещества под действием градиента его концентрации).
Теория диффузии веществ в водных растворах бази-
руется на гипотезе о том, что скорость переноса диффундирующего вещества через сечение единичной площади J
прямо пропорционально градиенту концентрации вещества
[C] в направлении, нормальном к плоскости сечения. Мате-
117
матически она описывается уравнениями, которые были
x
предложены А. Фиком
16
на основе анализа эксперименталь-
ных данных – соответствующие уравнения получили название законов Фика. Первый закон Фика описывает молекулярную диффузию вещества в отсутствие взаимодействий
диффундирующих частиц между собой или со средой:
J
grad[C]D
(4.1)
Для одномерной диффузии это уравнение можно записать в
упрощенном виде:
J
D
]C[
(4.2)
Второй закон Фика получают при рассмотрении баланса
диффузионных потоков в бесконечно малом объеме при нестационарном режиме процесса. Он описывает изменение
концентрации диффундирующего вещества во времени в
данной точке пространства:
]C[
])grad[C(D div
(4.3)
t
или, в упрощенном виде (при одномерной диффузии):
2
]C[
]C[
D(
D)
xxt
]C[
2
x
(4.4)
Таким образом, под коэффициентом диффузии D понимают коэффициент пропорциональности между потоком
вещества и градиентом концентрации этого вещества. Размерность коэффициента диффузии – длина
2
/время. При ис-
16
A. Fick. Ueber diffusion. – Annalen der Physik, 1855, Bd.94, p. 59–86.
118
пользовании системы СИ коэффициенты диффузии измеряются в м
ется размерность см
2
/с, хотя в литературе довольно часто использу-
2
/с.
Внешнедиффузионные эффекты в ферментативной
кинетике. Рассмотрим гетерогенную систему, в которой
субстрат ферментативной реакции находится в растворе, а
сам биокатализатор закреплен на поверхности частицы. В
этих условиях фундаментальную роль играют свойства
жидкости на поверхности раздела фаз. Качественные представления о закономерностях гетерогенных реакций были
сформулированы В. Нернстом. Согласно им вблизи поверхности твердого тела существует неперемешиваемый слой
внутри которого жидкость считается неподвижной и перенос вещества к поверхности твердого тела осуществляется
только за счет молекулярной диффузии. Перемешивание
раствора (конвекция) приводит к тому, что концентрация
вещества за пределами неперемешиваемого слоя постоянна.
Протекание реакции на поверхности твердой частицы будет
приводить к тому, что концентрация вещества вблизи поверхности станет
меньше, чем в исходном объеме раствора.
Схематично профиль изменения концентрации вещества в
рамках модели Нернста представлен на рис. 4.2.
,
Рис. 4.2. Профиль изменения концентрации вещества в рамках модели
Нернста для планарной диффузии. [S]
творе, [S]
– концентрация вещества на поверхности мембраны, l – тол-
l
щина неперемешиваемого слоя жидкости
– концентрация вещества в рас-
o
119
Какие осложнения при работе с иммобилизованными
l
ферментами могут возникать в данном случае? Для стационарной диффузии через плоский слой единичной площади
при постоянном коэффициенте диффузии решение уравнения (4.2) приводит к простейшему выражению для потока
диффундирующего вещества:
J
D
S
o
l
]S[]S[
(4.5)
Здесь l – толщина неперемешиваемого слоя, [S]
и [S]l –
o
концентрации субстрата в объеме раствора и на поверхности твердой частицы, D
– коэффициент диффузии субстра-
s
та.
Ферментативная реакция на поверхности описывается
уравнением Михаэлиса-Ментен, где концентрация субстрата равна [S]
:
l
[S]
V
max
l
v
K
m
[S]
l
(4.6)
В стационарном состоянии скорость диффузии субстрата и
наблюдаемая скорость ферментативной реакции равны между собой (J = -v, поскольку диффузионный процесс на-
правлен на увеличение концентрации [S]
, а ферментативная
l
реакция – на ее уменьшение), таким образом:
D
o
s
l
[S][S][S]
V
max
ll
[S]
K
m
l
(4.7)
Наиболее простое решение уравнения (4.7) получают в случае ферментативной кинетики первого порядка, когда
[S]
<<Km (небольшая концентрация субстрата в растворе,
l
большая скорость ферментативной реакции или толщина
120
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]