Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
где Cl и Co – соответственно концентрация какого-либо ком-
ψ
T
понента системы внутри частицы катализатора (локальная) и
в растворе (внешняя). Рассмотрим некоторые примеры влияния эффектов распределения на кинетику действия иммобилизованных ферментов на примере электростатических взаимодействий между носителем и растворенными веществами.
Если используемая матрица в условиях эксперимента заряжена и обладает некоторым электростатическим
циалом
, то концентрация протонов внутри нее будет от-
потен-
личаться от концентрации протонов в растворе согласно
уравнению Больцмана:
e
-
l
eH][[H]
o
kT
(4.22)
Здесь [H]
+
и [H]
l
+
- концентрации водородных ионов в но-
o
сителе биокатализатора и в растворе соответственно, е – заряд электрона, k – константа Больцмана, T – абсолютная
температура. Подставляя уравнение (4.22) в уравнение
(4.21), получаем:
e
[H]
[H]
l
o
P
H
e
kT
(4.23)
и, отсюда:
l
o
k
(4.24)
e
43,0pHpHpH
Таким образом, отрицательно заряженный носитель (полианионная матрица) будет концентрировать протоны и локальная величина рН
в носителе (при которой работает им-
l
мобилизованный фермент) становится более кислой, чем в
131
растворе. Для достижения рН-оптимума иммобилизованного фермента в таком носителе необходима более щелочная
внешняя реакционная среда, то есть происходит кажущийся
сдвиг рН-оптимума действия препарата в более щелочную
область. Для положительно заряженного носителя (поликатионная матрица) ситуация обратная, локальная величина
в носителе становится более щелочной и есть происхо-
рН
l
дит кажущийся сдвиг рН-оптимума действия препарата в
более кислую область. Экспериментальная иллюстрация
данных рассуждений приведена на рисунке 4.7.
100
80
60
A, %
40
20
0
1
45678910
2
3
pH
Рис. 4.7. рН-зависимости гидролиза этилового эфира N-ацетил-L-ти-
розина нативным химотрипсином (2) и препаратами фермента, иммоби-
лизованного в поликатионную (полиорнитил, (1)) и полианионную (со-
полимер этилена и малеиновой кислоты, (3)) матрицы
22
Субстрат иммобилизованного в носителе фермента также
может обладать зарядом. Наличие электростатических взаимодействий между субстратом и носителем должно менять
локальную концентрацию субстрата в рабочей зоне фермента. По аналогии с уравнением (4.22) запишем:
22
Рассчитано по: L. Goldstein. Environmental effects on enzyme catalysis/ A kinetic
study of polyanionic and polycationic derivatives of chymotrypsin. – Biochemistry,
1972, v.11, p.4072–4084.
132
ze
ψ
kT
l
eS][[S]o
(4.25)
где [S]
и [S]o – локальная и внешняя концентрация субстра-
l
та соответственно, z – заряд молекулы. Видно, что в случае
одинаковых зарядов матрицы и субстрата концентрация
субстрата на поверхности частицы носителя будет понижена по сравнению с концентрацией субстрата во внешнем
растворе. Наоборот, если субстрат и носитель заряжены
разноименно, то локальная концентрация субстрата в приповерхностном
слое матрицы будет больше, чем в растворе.
Скорость ферментативного процесса внутри частицы, согласно уравнению (4.16), определяется именно локальной
концентрацией субстрата, то есть
zeΨ
kT
V
'
V
K
eS][
omax
eS][
om
zeΨ
kT
(4.26)
откуда:
zeΨ
kT
KK e'
mm
(4.27)
Таким образом, из уравнения (4.27) видно, что если матрица
и субстрат заряжены одноименно, то наблюдаемая константа Михаэлиса для иммобилизованного препарата фермента
будет больше истинной константы Михаэлиса, характерной
для данного фермента при проведении аналогичной реакции
в растворе. Напротив, если заряды матрицы и субстрата
противоположны по знаку, то в эксперименте с
иммобилизованным ферментом будет наблюдаться кажущееся «повышение» сродства фермента к субстрату по сравнению с
133
раствором. Рисунок 4.8 подтверждает данные выводы. Действительно, при гидролизе положительно заряженного Nбензоил-L-аргининамида трипсином, включенным в отрицательно заряженную матрицу (сополимер этилена и малеиновой кислоты), наблюдаемая скорость реакции намного
выше, нежели для той же реакции в растворе, и величина
константы Михаэлиса для иммобилизованного фермента
практически на порядок меньше по сравнению
с нативным
биокатализатором.
1,0
0,8
2
0,6
max
V/V
0,4
0,2
0,0
0 10203040
1
[S]o, mM
Рис. 4.8. Зависимость относительной скорости ферментативной реакции
гидролиза положительно заряженного субстрата - N-бензоил-Lаргининамида - трипсином в растворе (кривая 1) и препаратом фермента, иммобилизованного в полианионной матрице (сополимер этилена и
малеиновой кислоты, кривая 2)
23
Вопросы для самоконтроля
1. Приведите примеры ферментов, использующихся в пищевой промышленности.
2. Перечислите наиболее крупнотоннажные производства
на основе ферментов.
3. На основе каких аналитических процедур с использованием ферментов производится экологический мониторинг
почвы и воды.
23
Рассчитано по: L. Goldstein, Y. Levin, E. Katchalski. A water-insoluble
polyanionic derivative of trypsin. II. Effect of the polyelectrolyte carrier on the kinetic
behavior of the bound trypsin. – Biochemistry, 1964, v.3, p.1913–1919.
134
4. В каких областях максимально широко используются
аналитические процедуры с использованием ферментов.
5. Какие базовые методы иммобилизации ферментов вы
знаете?
6. Чем внешнедиффузионный режим работы иммобилизованного фермента отличается от внутридиффузионного?
7. Приведите примеры влияния эффектов распределения
веществ между раствором и гетерогенной фазой на кинетическое поведение иммобилизованного фермента.
5. Ветеринарно-медицинская энзимология
Ветеринарно-медицинская энзимология традиционно делится на три раздела – энзимопатология, энзимодиагностика
и энзимотерапия.
5.1. Энзимопатология
Энзимопатология – это наука, изучающая энзимопатии,
то есть патологические состояния, вызванные снижением
(или полным отсутствием) активности того или иного фермента. Первичные (наследственные) энзимопатии связаны с
дефектными генами ферментов, которые получает ребенок
от родителей. Вторичные (приобретенные) энзимопатии
обусловлены снижением или полным прекращением синтеза белка, вызванным различными факторами в ходе жизненного цикла. По типу нарушений метаболизма энзимопатии делят на патологии липидного и углеводного обмена,
обмена аминокислот, нуклеиновых оснований и стероидов,
обмена в соединительной ткани, дефекты желудочнокишечного тракта и т. д.
В результате снижения ферментативной активности
уменьшается концентрация продуктов метаболического пути, в котором данный фермент участвует. Одновременно
возрастает концентрация
субстратов-предшественников, в
135
связи с чем активизируются побочные реакции, в которых
эти субстраты участвуют. Уменьшение концентрации продуктов, увеличение концентрации субстратовпредшественников и продуктов их побочных реакций – каждый из этих факторов в отдельности и в различных комбинациях и определяет наблюдаемую клиническую картину
болезни.
Недостаточное образование продуктов. Классическим
примером энзимопатологии, связанной со снижением концентрации продуктов метаболического пути, является альбинизм – группа патологий, характеризующихся нарушениями пигментации кожи, волос, радужной оболочки глаза.
Пигментация кожи определяется высокомолекулярными
пигментами – меланинами, которые синтезируются в специализированных клетках (меланоцитах). Начальной стадией синтеза меланинов является окисление тирозина ферментом тирозиназой с
образованием диоксифенилаланина
(ДОФА). Продукты полимеризация последнего в виде хинонной формы и представляют собой меланины. В большинстве случаев альбинизм связан именно с мутациями гена тирозиназы. Наиболее тяжелая форма болезни (глазокожная 1А) обусловлена так называемой nonsense-мутацией
гена alb-OCA1, при которой синтеза тирозиназы не происходит. При других мутациях данного
гена (их описано уже
около пятидесяти) фермент синтезируется, но активность
его понижена и зависит от конкретной мутации. В ряде случаев болезнь проявляется только в виде слегка более светлого оттенка кожи и волос.
Другим примером такого рода патологий является гемофилия, болезнь, связанная с нарушением коагуляции (системы свертывания крови
). Система свертывания крови
представляет собой каскад реакций, в каждой из которых
путем ограниченного протеолиза образуются активные
компоненты следующих стадий. Конечный результат процесса – протеолиз фибриногена тромбином с образованием
фибринопептидов, которые затем образуют нити фибрина
136
(собственно тромб, стягивающий рану). Активация тромбина
из протромбина проходит под действием «активатора протромбина» – комплекса активированного фактора Xa и фосфолипопротеина Va. Для активации фактора Х в свою очередь необходим комплекс факторов VIIIa и IXa. Примерно в
85 % случаев гемофилия вызывается наследственной недостаточностью синтеза факторов VIII (гемофилия А) и IХ (гемофилия В) и
проявляется в частых кровотечениях и кровоизлияниях в результате травм. Заболевание характерно для
мужчин. Дело в том, что гены, кодирующие данные белки
(Xq28 для FVIII и Xq27 для FIX), локализованы в Ххромосоме. У женщин даже при наличии мутации в одной из
Х-хромосом вторая обеспечивает достаточный уровень факторов свертывания крови. Известны лишь
единичные случаи
женской гемофилии при наследовании гена одновременно от
отца (больной гемофилией) и матери (носителя гена).
Накопление субстрата-предшественника. Увеличение
концентрации субстрата-предшественника является причиной многих энзимопатологий липидного обмена. Катаболизм
сфинголипидов и гликолипидов (важных компонентов плазматических мембран) протекает в лизосомах, наиболее интенсивно – в мозге и богатых макрофагами печени и селезенке. В результате нарушения этого процесса в клетках накапливаются нерасщепленные липиды, приводя к поражению
важных
для жизни органов.
Болезнь Гоше, например, связана с лизосомальным фер-
ментом -глюкозилцереброзидазой, расщепляющей глюкозилцереброзид на церамид и глюкозу. При малой активности фермента нерасщепленный субстрат накапливается в
макрофагах и моноцитах («нагруженные» липидами клетки
называют клетками Гоше). При этом увеличиваются селезенка и печень, костные нарушения связаны с разрастаниями патологических клеток в костном мозге, отмечается отставание в физическом и умственном развитии.
Болезнь Нимана-Пика объединяет группу заболеваний,
причиной которых является дефицит сфингомиелиназы, в
137
норме гидролизующей сфингомиелин. Отложения сфингомиелина приводит к поражению внутренних органов центральной нервной системы. GM
-ганглиозидозы связаны с
2
недостаточной активностью гексозаминидазы А (фермент
отщепляет остаток N-ацетил-D-гексозамина от GM
2
ганглиозидов), что приводит к накоплению нерасщепленных липидов в клетках головного и спинного мозга с прогрессирующим их разрушением. Сам фермент представляет
собой / гетеродимер и для проявления активности требует наличия белка-активатора GM2А. В этой связи в настоящее время различают три варианта данного заболевания, не
различающиеся
клинически, но имеющие разные генетиче-
ские причины. Болезнь Тея-Сакса связана с мутацией гена
HEXA (кодирует -субъединицу), при болезни Сандхоффа
мутация находится в гене HEXB (кодирует -субъединицу).
Нарушения в гене GM2, кодирующим белок-активатор
GM2A, вызывает GM
-ганглиозидоз, АБ вариант.
2
С повышением концентрации субстрата дефектного фермента связан также синдром Криглера-Найяра. Билирубин
(несвязанный, непрямой) является продуктом расщепления
гема гем-содержащих белков. Этот желчный пигмент плохо
растворим в воде и способен легко встраиваться в липидную клеточную мембрану. Проникая в митохондрии, он разобщает в них дыхание
и окислительное фосфорилирование, что отрицательно сказывается на состоянии нервной
системы. Первым симптомом повышения концентрации билирубина в крови является развитие желтухи. При дальнейшем повышении концентрации соединение начинает
проникать в головной мозг, приводя к повреждению базальных ядер. В норме непрямой билирубин связывается с альбуминами крови, транспортируется в
печень и конъюгируется с глюкуроновой кислотой под действием УДФглюкоронидазы. В результате образуется прямой (связанный) билирубин – малотоксичный водорастворимый продукт, выводимый в дальнейшем из организма с калом и мо-
-
138
чой. Мутации в гене UGT1A1, кодирующем УДФглюкоронидазу, приводят к недостаточной активности фермента (2-й тип) или полному ее отсутствию (1-й тип). Синдром Криглера-Найяра 1-го типа характеризуется стремительным течением – первые признаки в виде желтухи появляются через несколько часов после рождения, а смерть наступает в течение 1–2 лет. При
синдроме Криглера-Найяра
2-го типа активность фермента составляет 20–30 % от нор-
мы, что позволяет при правильно назначенных терапевтических мероприятиях продлить жизнь больным и даже избежать нарушений центральной нервной системы.
Накопление продуктов побочных реакций субстрата.
Фенилкетонурия является одной из наиболее распространенных патологий обмена аминокислот. Фенилаланин в организме окисляется до тирозина фенилаланингидроксилазой
(ФАГ), при этом существует реакция его переаминирования
в фенилпировиноградную кислоту (равновесие здесь сильно
сдвинуто в сторону фенилаланина). Отсутствие активности
ФАГ приводит к повышению концентрации фенилаланина в
организме. Как следствие, увеличивается и концентрация
фенилпирувата, вызывающего токсическое повреждение
нервной системы (в отсутствие лечения достаточно быстро
достигается степень имбецильности). Рекомендованная
процедура лечения – пожизненная диета с очень низким содержанием фенилаланина.
К этому же типу энзимопатий можно отнести и упоминавшуюся ранее (см. раздел 4.1) непереносимость лактозы,
вызываемую низким уровнем синтеза пищеварительного
фермента лактазы. Патология может иметь как
наследст-
венный, так и приобретенный характер.
Накопление субстрата-предшественника и продуктов
его побочных реакций. Галактоземия связана с нарушени-
ем утилизации галактозы в организме. Основной путь метаболизма галактозы (входящей в состав лактозы, основного
углевода молока) включает ряд последовательных реакций.
Вначале она фосфорилируется в галактозо-1-фосфат под дей-
139
ствием галактокиназы. Далее галактозо-1-фосфатуридилтрансфераза катализирует образование УДФ-галактозы,
которая затем изомеризуется в УДФ-глюкозу УДФ-галакто4-эпимеразой.
При этом имеются не очень значимые в норме пути
трансформации галактозы, например, галактодегидрогеназа
окисляет галактозу в галактоновую кислоту, а альдозоредуктаза восстанавливает галактозу в галактитол. Недостаток любого из трех ферментов
основного пути метаболизма галактозы в первую очередь приводит к повышению ее концентрации в крови, что снижает печеночную продукцию глюкозы (гипогликемия). Галактитол, накапливаясь в хрусталике
глаза, способствует образованию катаракты. При дефиците
активности галактозо-1-фосфатури-дилтрансферазы (класси-
ческая галактеземия I типа) возрастает и концентрация галактозо-1-фосфата, обладающего ингибирующей активностью
по отношению к другим ферментам углеводного обмена и вызывает торможение транспорта аминокислот в почках
и кишечнике. Лечение данного заболевания состоит в исключении из диеты продуктов, содержащих галактозу, в первую очередь молока и молочных продуктов.
Отрицательные свойства некоторых мутаций в генах
ферментов могут проявляться только при определенных условиях. Так, бутирилхолинэстераза человека (БуХЭ) участвует в процессах метаболизма широкого круга антибиотиков, в том числе гидролизует используемый в медицине
миорелаксант сукцинилхолин. Известно несколько изоформ
фермента, отличающихся различными единичными заменами в аминокислотной последовательности белка. Никакого
влияния на качество жизни людей в обычных условиях эти
замены не оказывают. Однако мутация
Asp98Gly многократно снижает связывающую способность БуХЭ по отношению к положительно заряженным субстратам. Люди с
таким генотипом аномально реагируют на введение миорелаксанта – 2–5-часовая асфикция (на фоне 3–5-минутной в
норме) и продолжительный паралич.
140
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]