Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
[P]
[
]
P
A
время
Рис. 3.10. Зависимость накопления продукта ферментативной реакции от
времени в стационарном (А) и нестационарном (Б) режимах. Общий вид
время
Б
Интегрируя уравнение (3.54) и подставляя величину [P] из
уравнения материального баланса по субстрату ([P] = [S]
– [S]),
o
получаем интегральную форму уравнения Михаэлиса-
Ментен:
[S]
KtV
ln]P[
mmax
o
o
[P][S]
(3.55)
Наиболее известный способ приведения уравнения (3.55)
к линейному виду – метод Уокера-Шмидта – заключается
в делении правой и левой частей этого уравнения на t. В
этом случае имеем:
[P]
t
max
K
t
V
ln
[S]
o
om
[P][S]
(3.56)
.
и зависимость в координатах [P]/t от 1/t
{ln([S]o/([S]o-[P]))}
будет иметь вид прямой линии с тангенсом угла наклона,
равным –K
равный величине V
, отсекающей на оси ординат отрезок, численно
m
(рис. 3.11).
max
71
[P]/
t
V
max
tg = -K
Рис. 3.11. Определение параметров уравнения Михаэлиса-Ментен по
m
1/t*ln{[S]o/([S]o - [P])}
методу Уокера-Шмидта
Другой метод обработки интегрального уравнения скорости реакции, не требующий знания абсолютных значений
параметров реакции (начальной концентрации субстрата,
начального времени реакции, абсолютной концентрации
продукта реакции и т. д.) предложен Березиным и Клесо-
9
вым
. Рассмотрим кривую накопления продукта реакции
(рис. 3.12), где величина D – изменение характеристик сис-
темы, удобных для регистрации (оптическая плотность,
электропроводность и т. д.). В общем случае [P] = (D-D
где – коэффициент пересчета, а D
и D – значения, соот-
o
),
o
ветствующие начальному и текущему моменту времени.
Тогда уравнение (3.55) можно записать в виде:
)Dα(D
t
1
V
max
K
o1
m
ln
V
max
DD
omax
DD
1max
(3.57)
9
И. В. Березин, А. А. Клесов. Практический курс химической и фермен-
тативной кинетики. – М.: Изд-во МГУ, 1976, 320 с.
72
D
D'
3
2
D
max
3
время
D'1D'
D
3
2
D
1
D
o
t1 t2 t3 t'1 t'2 t'
Рис. 3.12. Кинетическая кривая накопления продукта ферментативной
реакции. D – физический параметр, удобный для регистрации кинетики
Для момента времени t’
, равного t1 + , справедливо:
1
'
)Dα(D
'
1
tt
1
1
V
max
K
o
m
ln
V
max
DD
omax
'
DD
1max
(3.58)
Аналогичные пары уравнений будет верны и для других
пар временных точек (t
и t’2, t3 и t’3 и т. д., рис. 3.12), отли-
2
чающихся на одну и ту же величину . Вычитая уравнение
(3.57) из уравнения (3.58), получаем:
'
)Dα(D
1
V
max
K
1
m
ln
V
max
DD
1max
'
DD
1max
(3.59)
или, в более общем виде:
DD
'
DD
1
1
KV
ln
αα
1maxmmax
'
DD
1max
(3.60)
73
Таким образом, при построении экспериментальных данных в координатах D’
ем прямую с тангенсом угла наклона –K
сечения на оси ординат V
V
max
i
tg = -Km/
- D
i
D'
i-Di
max
*
от ln{(D
max-Di
*/ (рис. 3.13).
)/D
-D’I)} получа-
max
/ и точкой пере-
m
ln{(D
Рис. 3.13. Определение параметров уравнения Михаэлиса-Ментен по
методу Березина-Клесова
max
- Di)/(D
max
- D'i)}
По сравнению с методом Уокера-Шмидта данный метод
не требует знания абсолютной начальной концентрации
субстрата – ее заменяет величина [P]
[S]
. Обработку одной и той же кривой можно проводить
o
, которая и равна
max
несколько раз с использованием разных временных интервалов , что существенно повышает точность определяемых
параметров уравнения Михаэлиса-Ментен. С другой стороны, необходимым условием для применения метода Березина-Клесова является полная уверенность в реальном достижении конечной величины параметра D
(то есть полного
max
окончания реакции), что требует достаточно долгого времени для получения экспериментальных зависимостей. Помимо всего вышесказанного, этим методом невозможно обрабатывать экспериментальные точки, полученные через нерегулярные временные интервалы, что не является проблемой для метода Уокера-Шмидта.
Наличие в реакционной смеси обратимого ингибитора
ферментативной реакции будет
влиять на экспериментально
74
определяемые методами интегральной кинетики величины
K
m
и V
. Однако обработка полученных данных аналогич-
max
но приемам, разобранным в предыдущих разделах, позволяет определить тип ингибирования и рассчитать величины
констант ингибирования.
Следует откровенно признать, что, не смотря на кажущуюся простоту, интегральные методы обработки экспериментальных данных сильно уступают в точности методам
стационарной кинетики. Кроме того, имеются частные случаи,
которые любопытны с точки зрения кинетики, но сильно осложняют применимость этих методов на практике. К
подобным случаям следует отнести ингибирование продук-
том реакции.
Конкурентное ингибирование фермента продуктом фер-
ментативной реакции можно выразить следующей схемой:
K
P
EP
(3.61)
E+S
K
S
ES E + P
k
2
Кинетический анализ схемы (3.61) в рамках интегрально-
го подхода приводит к уравнению:
[S]
o
K
K
K
P
ln
m
P
[S]
o
o
[P][S]
(3.62)
[P]
t
1
K
m
V
max
K
m
1
K
P
1
t
Из рассмотрения уравнения (3.62) видно, что в том случае, когда сродство продукта реакции к ферменту больше,
чем сродство субстрата (K
< Km), оба члена в правой части
P
приобретают знаки, противоположные по сравнению с
уравнением (3.56). Таким образом, построение данных по
методам интегральной кинетики даст физически бессмысленные (отрицательные) величины максимальной скорости
75
реакции и константы Михаэлиса. При этом довольно большое число ферментативных реакций происходит с образованием продуктов-ингибиторов (в качестве примера приведем лишь реакции, протекающие с накоплением или расходованием протонов – в этом случае в безбуферной среде будет происходить сдвиг величины рН, которая, как уже рассматривалось выше, сильно
влияет на активность фермента). Это означает, что при наличии полной кинетической
кривой, применение интегральных методов обработки экспериментальных данных не всегда гарантирует положительный результат. Следует учитывать и возможную инактивацию фермента в ходе реакции, что тоже может приводить к нелинейной кинетике накопления продукта реакции
от времени. Однако
при наличии опыта работы и известного
желания всегда возможно предложить план экспериментов
с последовательным учетом возможных кинетических осложнений для того, чтобы выделить влияние каждого из
факторов, влияющих на получаемые экспериментальные
данные.
3.5. Влияние рН на скорость ферментативных реакций10
Многие аминокислоты, «строительные кирпичи» белко-
вых молекул, обладают функциональными группами, спо-
10
Следует отметить, что само понятие «водородный показатель»
было введено в химию С. П. Л. Серенсеном при изучении влияния среды на активность ферментов. Свои результаты он опубликовал одновременно в Германии и Франции: Sørensen, S. P. L.
Enzymstudien. II: Mitteilung. Über die Messung und die Bedeutung
der Wasserstoffionenkoncentration bei enzymatischen Prozessen, –
Biochemische Zeitschrift, 1909, v.21, p.131–304. Sørensen, S. P. L.
Enzymstudier II. Om Maalingen og Betydningen af
Brintionkoncentrationen ved enzymatiske Processer. – Meddelelser fra
Carlsberg Laboratoriet, 1909, v.8, p.1–153.
76
собными к ионизации (аминогруппы, карбоксильные груп-
K
пы и т. д.). Возможность участия данной группы в катализе
с очевидностью зависит от ее ионного состояния. Оптимальный для катализа баланс заряженных и незаряженных
групп определяет величину рН-оптимума данного фермента – значение рН (pH lg [H
+
]), при котором наблюдает-
ся максимальная активность биокатализатора. Рассмотрим
простейший случай влияния рН среды на кинетику двухстадийной реакции (схема (3.63)).
Символы E, EH, EH
и т. д. описывают состояния иони-
2
зации групп, участвующих в ферментативной реакции.
Равновесные константы протонирования (диссоциации)
для фермент-субстратного комплекса обозначены апострофами, подстрочники «a» и «b» относятся к стадиям протонирования в кислой (от англ. acid) и в щелочной (от
англ. base) области.
K'
S
EH2+S
EH2S
EHS
ES
K'
K'
a
k
2
EH + P
b
(3.63)
+[H+]
+[H+]
a
EH + S
K
b
E+S
K
K''
S
+[H+]
+[H+]
S
Вывод уравнения скорости ферментативной реакции ведется в предположении о том, что все равновесные процессы в схеме (3.63) протекают значительно быстрее самого
химического превращения субстрата. Такое допущение разумно, поскольку скорость обмена протонов обычно очень
высока. Кинетические параметры уравнения Михаэлиса-
77
Ментен (кажущиеся константы каталитическая и Михаэлиса) запишутся в этом случае, как:
k
k
кажкат,
2
][H
1
'
K
a
'
K
b
][H
(3.64)
и
K
][H
1
K
KK
Sкажm,
a
][H
1
'
K
a
b
][H
'
K
b
][H
(3.65)
По аналогии с действием обратимых эффекторов можно
сказать, что увеличение концентрации протонов (уменьшение рН среды) будет приводить вначале к «активации» фермента (первая стадия протонирования (K
, Kb’) исходно не-
b
протонированной формы фермента Е в схеме (3.63)). Дальнейшее изменение рН будет приводить ко второй стадии
протонирования фермента (K
, Ka’), где наблюдается эффект
a
«ингибирования». Суммарно вид зависимости активности
фермента от рН реакционной среды будет иметь вид колоколообразной кривой. Максимум кривой (собственно рНоптимум) для большинства ферментов лежит в физиологическом интервале значений рН среды (5–9), но пепсин, например, проявляет максимальную активность при рН = 2, а аргиназа – при рН = 10.
Графический
анализ зависимости k
от рН позволяет
кат,каж
найти величины отрицательного десятичного логарифма
констант диссоциации ионогенных групп ферментсубстратного комплекса (рK’
и рK’b), а аналогичный анализ
a
рН-зависимости эффективной константы скорости второго
порядка k
кат,каж/Km,каж
приводит к значениям рК диссоциации
ионогенных групп свободного фермента. Рассмотрим более
78
подробно принцип такого анализа на примере зависимости
k
от рН (рис. 3.14).
кат,каж
-0,4
3
-0,6
)
-0,8
-1,0
2
1
кат,каж
-1,2
lg(k
-1,4
-1,6
345678910
pK'a
pH
pK'
b
Рис. 3.14. Схематичное изображение графического определения вели-
чин рК фермент-субстратного комплекса
При низких концентрациях протонов (в щелочной облас-
+
ти) [H
] << K’a и [H+] << K’b, то есть [H+]/K’a << 1, K’b/[H+]
>> 1. Тогда уравнение (3.63) трансформируется к виду
k
прямолинейную зависимость lg(k
lgk
= k2[H+]/K’b. После логарифмирования получаем
кат,каж
) от pH (lg(k
кат,каж
lgK’b – pH) с тангенсом угла наклона, равным единице
2 -
кат,каж
) =
(прямая 1 на рис. 3.14). Аналогичные рассуждения для ки-
+
слой области (высокая концентрация протонов, [H
+
] >> K’b, то есть [H+]/K’a >> 1, K’b/[H+] << 1) позволяют
и [H
получить уравнение lg(k
кат,каж
) = lgk
lgK’a + pH (прямая 2
2 +
на рис. 3.14). Наконец, для нейтральной области, где [H
([H+]/K’a << 1), а [H+] >> K’b (K’b/[H+] << 1) можно запи-
K’
a
сать lg(k
) = lgk2 (прямая 3 на рис. 3.14). В точках пере-
кат,каж
] >> K’a
+
] <<
сечения двух различных функций их аргументы равны между собой. Приравнивая аргументы прямых 1 и 3 на рисунке
3. 14 в точке их пересечения, получим рН = рK’
. Аналогич-
b
ным образом для точки пересечения прямых 2 и 3 имеем рН
= рK’
. В предположении о том, что связывание субстрата
а
79
не влияет на константу ионизации (pK = pK’), величина рН-
R
оптимума определяется как полусумма этих величин, то
есть рН
= (pK + pK’)/2.
оптимум
Следует отметить, что на практике наблюдаемая картина
зависимости активности фермента от рН обычно бывает гораздо более сложной – в состав активного центра могут
входить много ионизующихся групп, ионизации может подвергаться субстрат ферментативной реакции и т. д. Даже в
простейшем рассмотренном здесь случае графический метод определения величин
рK ионогенных групп дает только
достаточно грубую оценку их значений, которые можно использовать как начальные приближения для дальнейшего
анализа зависимости методом нелинейной регрессии.
3.6. Влияние температуры на скорость ферментативной
реакции
Влияние температуры на кинетическое поведение ферментов практически невозможно описать в строгом физикохимическом виде. Согласно закону Вант-Гоффа, влияние
температуры на константу равновесия химической реакции
выражается уравнением:
ln
Kd
dT
H
2
T
(3.66)
или
ln
d
Kd
1
T
H
-
R
(3.67)
где Н – энтальпия равновесного процесса, R – универсальная газовая постоянная, Т – абсолютная температура. Видно, что график зависимости в координатах lnK – 1/T должен
иметь вид прямой с тангенсом угла наклона -Н/R (рис.
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]