Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
Если спектры субстрата и продукта сильно перекрываются (или коэффициенты молярного поглощения данных веществ малы), то для фотометрического метода возможно
использование дополнительных реакций. В реакционную
смесь при этом добавляют избыток реагента, который взаимодействует с продуктом ферментативной реакции, образуя
окрашенное вещество. Так, например, определение пируватиона (продукта многих ферментов) проводится
в присутствии 2,4-динитрофенил-гидразина. Взаимодействие этих веществ приводит к образованию ярко окрашенного 2,4динитрофенилгидразона, максимум поглощения которого
приходится на длину волны 490 нм.
Турбидиметрия. Интенсивность проходящего через кю-
вету луча видимого света может уменьшаться не только за
счет его поглощения растворенным веществом. Световой
пучок рассеивается, проходя через суспензии, эмульсии и
коллоидные растворы (эффект Тиндаля), что приводит к
уменьшению пропускания слоя. На практике это означает
связь измеряемой оптической плотности суспензии с ее
мутностью, зависящей не только
от концентрации частиц,
но и от их размера и формы. Чаще всего в энзимологии этот
метод применяют для изучения бактериолитических ферментов, где субстратом является целая клетка. Разрушение
клеточной стенки ферментом вызывает лизис бактерии –
разрыв клетки вследствие осмотического шока с высвобождением компонентов цитоплазмы. Уменьшение же числа
клеток в ходе
процесса приводит к наблюдаемому снижению оптической плотности суспензии и позволяет регистрировать скорость реакции.
Как говорилось выше, пропускание суспензий сильно зависит от размеров и формы частиц – для разных бактерий
единица оптической плотности соответствует концентрации
7
–109 клеток/мл. Однако в сильно разбавленных суспен-
10
зиях мутность среды описывается законом БугераЛамберта-Бера (для клеточных суспензий, например, линейность оптической плотности от концентрации клеток
31
лежит в диапазоне от 0 до 0,5). Следует отметить, что при
использовании стандартного фотометра в качестве регистратора мутности среды при ферментативном лизисе клеток
есть опасность наложения процесса поглощения света высвобождающимися компонентами цитоплазмы. В этой связи
для регистрации кривых лизиса обычно применяют длинноволновое излучение (550–650 нм).
Флуориметрия. Находящаяся в возбужденном энергети-
ческом состоянии молекула в некоторых случаях способна
перейти в основное состояние, «сбрасывая» избыток энергии в виде кванта света. Если возбуждение произошло в результате предварительного поглощения кванта света, то такой процесс называют фотолюминесценцией или флуоресценцией. Функциональные группировки в составе молекулы, обеспечивающие флуоресценцию, называют
флуорофо-
рами. Зависимость оптической плотности раствора вещества от длины волны в данном случае называют спектром
возбуждения, а зависимость интенсивности флуоресценции
раствора вещества (числа испускаемых квантов) от длины
волны излучаемого света называют спектром испускания.
Флуоресценция характеризуется несколькими закономерностями. Закон Стокса–Ломмеля гласит, что спектр излучения в целом и
его максимум в частности всегда сдвинуты в сторону более длинных волн по сравнению со спектром возбуждения (поглощения). Это связано с частичными
потерями энергии возбужденного состояния молекулы в ходе безызлучательных процессов. С другой стороны, форма
спектра испускания не зависит от длины волны возбуждающего света (правило Каши). Иными словами
, спектр испускания возбужденного флуорофора зависит только от
особенностей его флуоресценции вне зависимости от пути
его перехода в возбужденное состояние.
Очевидно, что максимальная чувствительность данного
метода зависит от числа возбужденных молекул и интенсивности испускаемого света. В этой связи обычно длина волны
возбуждающего света совпадает с максимумом на спектре
32
возбуждения, а регистрация процесса ведется на длине волны, соответствующей максимуму на спектре испускания субстрата или продукта реакции. В этих условиях и строится калибровочная зависимость интенсивности флуоресценции от
концентрации флуоресцирующего вещества.
Эффект резонансного переноса энергии по Ферстеру
(Forster resonance energy transfer, FRET) позволил разрабо-
тать большое количество флуоресцентных субстратов для
различных гидролитических ферментов.
В основе FRET лежит эффект возникновения резонанса между близкими
энергетическими уровнями находящихся недалеко друг от
друга (20–50 нм) флуорофора-донора и хромофораакцептора. Если спектр испускания донора совпадает со
спектром поглощения акцептора (перекрывание спектров,
условие необходимое, не недостаточное), то перенос энергии с возбужденного донора на акцептор происходит безызлучательно. На практике
это приводит к тушению флуоресценции донора, эффективность которой падает обратно
пропорционально шестой степени расстояния между взаимодействующими группировками. Таким образом, если молекула субстрата содержит в своем составе донор и акцептор, то флуоресценция раствора незначительна. При гидролизе такого субстрата донор и акцептор расходятся в пространстве и
происходит разгорание флуоресценции.
Люминометрия. Переход молекулы в возбужденное со-
стояние не обязательно должен быть связан с поглощением
кванта света. В реакциях ферментативного окисления некоторых субстратов (люциферинов) продукты окисления обра-
зуются в возбужденном состоянии, и их переход в основное
состояние сопровождается излучением кванта света. В природе этот процесс – биолюминесценцию – обеспечивают ферменты люциферазы. Поскольку
стехиометрия реакции 1:1
(один квант света на одну молекулу трансформированного
субстрата), то интенсивность светового потока прямо пропорциональна скорости реакции. В отличие от спектрофото-
33
метров и спектрофлуориметров приборы для люминометрии
(люминометры) не требуют наличия источника света.
Поляриметрия (дисперсия оптического вращения).
При прохождении через раствор оптически активного вещества плоскость поляризации плоскополяризованного света
отклоняется от исходной ориентации влево или вправо в
зависимости от пространственной структуры энантиомера.
Степень вращения
(угол отклонения плоскости поляриза-
ции от исходной) зависит от длины волны света, природы
вещества, его концентрации с и длины оптического пути l:
cl][
, (2.4)
где [
] – удельное вращение. Эта величина для каждого вещества определяется как выраженное в градусах вращение
раствора с концентрацией 1 г/мл в кювете с длиной оптического пути 10 см. Данный метод позволяет следить за активностью ряда изомераз.
Потенциометрия. Электродный потенциал электрохи-
мической ячейки при нулевом токе E (электродвижущая сила, ЭДС) зависит от активности окисляемых или восстанавливаемых участников реакции согласно уравнению Нернста
(для реакции в сторону восстановления):
zF
a
Ox
,
a
R
(2.5)
RT
o
EE ln
где R – универсальная газовая постоянная, Т – температура,
F – число Фарадея, z – число электронов, участвующих в
реакции, a
и aR – активности окисленной и восстановлен-
Ox
ной форм участников реакции соответственно, которые в
разбавленных растворах можно считать равными обычным
концентрациям. Именно таким образом определяют рН среды – измеряют ЭДС электродной системы, состоящей из
стеклянного электрода (чувствительного к ионам водорода)
34
и электрода сравнения (стандартный электрод с известной
величиной потенциала, чаще всего насыщенный каломельный или хлорсеребряный).
Если в ходе ферментативной реакции происходит изменение величины рН среды, то регистрировать ее скорость
возможно при использовании рН-стата. Прибор представляет собой традиционный рН-метр, объединенный с титратором. При изменении заданной величины
рН в растворе
(уменьшение или увеличение концентрации протонов) на
титратор подается сигнал для подачи в ячейку щелочи (или
кислоты) до восстановления исходного значения рН. В ходе
реакции записывается количество подаваемого реагента как
функция времени, что позволяет в дальнейшем рассчитать
скорость реакции.
Амперометрия. При подаче определенного напряжения
между рабочим электродом и электродом сравнения на поверхности рабочего электрода может происходить окисление или восстановление электрохимически активных веществ. Возникающий при этом ток I в общем случае прямо
пропорционален концентрации вещества С в растворе:
kCI
(2.6)
Данный метод широко применяется для определения активности оксидоредуктаз. В первую очередь это электрод
Кларка для измерения концентрации растворенного в реакционной среде кислорода (субстрата многих окислительновосстановительных ферментативных реакций). Он представляет собой платиновый электрод, покрытый гидрофобной мембраной. Кислород диффундирует через мембрану к
электроду и восстанавливается с
переносом четырех электронов. Активность фермента определяется по скорости
убыли концентрации кислорода в растворе (снижение тока).
При этом, следует предотвращать поглощения измерительной ячейкой кислорода из воздуха.
35
Более предпочтительно амперометрическое определение
концентрации пероксида водорода, продукта реакций многих оксидоредуктаз. Модифицированные медиаторами
электронного переноса электроды имеют весьма низкие
пределы его обнаружения – так, покрытые берлинской лазурью электроды позволяют определять субмикромолярные
концентрации пероксида водорода по току восстановления.
Процесс в данном случае происходит при нулевом потенциале относительно хлорсеребряного электрода, что
позволяет исключить возможные искажения сигнала при работе в
сложных биологических системах.
В ряде случаев применяются и биферментативные системы. Так, ацетилхолинэстераза гидролизует ацетилхолин с
образованием холина и ацетат-иона. Регистрировать скорость данной реакции можно потенциометрически с использованием рН-стата. Однако чувствительность этого метода, особенно в кислых
средах достаточно низка. Введение
в реакционную среду холиноксидазы приводит к окислению
холина до бетаина с образованием пероксида водорода. Поскольку стехиометрия последовательной реакции 1:1, то ток
восстановления пероксида прямо пропорционален активности ацетилхолинэстеразы.
Манометрия. Во многих ферментативных реакциях
принимают участие газообразные вещества как субстраты
или продукты процесса – кислород в реакциях оксидоредуктаз, диоксид водорода в реакциях карбоксилаз и декарбоксилаз, азот в реакциях нитрогеназ. Манометрический
метод, разработанный О. Варбургом (O. Warburg), является
одним из наиболее старых методов определения активности
ферментов. Он подходит для детекции как убыли, так
и накопления всех типов газов, и основан на измерении объема
газа над реакционным раствором.
Вискозиметрия. Данный метод применяется для опреде-
ления активности эндодеполимераз в реакции гидролиза
полимерных субстратов (обычно гидролиз полисахаридов
эндоглюканазами). Для этого используют вискозиметр
36
Оствальда – U-образную стеклянную трубку, в одно колено
которой впаян капилляр с шариком фиксированного объема. Второе колено представляет собой широкую трубку.
Определенное количество жидкости наливают в широкую
трубку, поднимают по капилляру до полного заполнения
шарика и засекают время ее истечения из шарика. При прочих равных условиях (диаметр капилляра, объем шарика
температура) время истечения жидкости прямо пропорцио-
нально вязкости
раствора. Эта величина зависит как от
весовой концентрации полимера, так и от его молекулярной
массы. Ферментативный гидролиз полимерного субстрата в
вискозиметре уменьшает его средневесовую молекулярную
массу, то есть уменьшает вязкость раствора. Таким образом,
измерение времени истечения реакционной среды через определенные промежутки времени позволяет определять активность использованного препарата фермента.
Определение общей протеолитической активности.
Протеолитические ферменты отличаются большим разнообразием специфичности по отношению к аминокислотам,
образующим гидролизуемую пептидную связь. Для определения активности большинства протеиназ применяют синтетические субстраты, соответствующие специфичности
конкретного фермента. При определении общей протеолитической активности в качестве субстрата используют модельные белки, чаще всего гемоглобин или казеин. За ходом
реакции следят
по накоплению в супернатанте низкомолекулярных продуктов гидролиза после осаждения высокомолекулярного субстрата трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и
последующего центрифугирования реакционной среды.
Наиболее простым методом является измерение оптической
плотности при 280 нм (поглощение ароматических остатков
аминокислот), однако он малочувствительный. Повышения
чувствительности можно добиться с помощью ковалентно
модифицированного красителями белка (например, азоказеина),
но это удорожает стоимость процедуры. В методе
Ансона измеряют восстанавливающую способность супер-
37
,
натанта в реакции с реактивом Фолина-Чокалтеу – окисление фенолов этим реагентом приводит к возрастанию оптической плотности в длинноволновой области (600–750 нм).
Результаты выражают в единицах Ансона (AU) – количество
фермента, действие которого приводит к появлению окраски, соответствующей миллиэквиваленту тирозина (именно
по нему и строится калибровочная кривая) в данных условиях проведения
эксперимента. Проблемой интерпретации
результатов является то, что реактив Фолина-Чокалтеу чувствителен не только к тирозину и триптофану, но и цистеину и гистидину.
Известны также методы прямого титрования появляющихся в ходе протеолиза аминогрупп в реакциях с нингидрином или 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой. Эти методы не требуют осаждения реакционной смеси
ТХУ, однако
из-за высокого уровня фонового сигнала (белок как субстрат исходно имеет достаточно большое количество свободных аминогрупп) их чувствительность не очень высока.
Хроматография. Если оптические характеристики суб-
страта (субстратов) и продуктов ферментативной реакции
близки между собой, то автоматический мониторинг процесса становится невозможным. В этом случае можно воспользоваться хроматографическим разделением реакционной смеси на заранее подобранных системах (размер колонки, природа носителя, элюирующий раствор). В предварительных экспериментах требуется построение зависимости
площади выходящего
с колонки пика вещества от его содержания в наносимом на колонку растворе. К сожалению,
данный метод определения ферментативной активности
весьма трудоемок – построение кинетической кривой происходит по точкам, временной интервал между которыми
определяется временами выхода с колонки исследуемых
веществ.
Вопросы для самоконтроля
1. Дайте определение хроматографии.
38
2. Чем различаются процедуры смыва белков с колонки при
анионообменной и гидрофобной хроматографии?
3. Какими методами можно обессолить раствор белка?
4. Перечислите методы определения молекулярной массы
белка.
5. Как определить изоэлектрическую точку белка?
6. Какими методами подтверждают аминокислотную последовательность выделенных белков?
7. На конкретном примере опишите физико-химический метод определения активности ферментов
.
3. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА
Ферментативная кинетика – это раздел химической кинетики, науки, изучающей механизмы и закономерности протекания химических реакций во времени в зависимости от
концентраций реагирующих веществ, состава среды и
внешних условий проведения эксперимента (базовые понятия и определения химической кинетики приведены в Приложении 3). Именно кинетика является основным методическим подходом для исследования
тивного катализа. Количественное описание ферментативных реакций крайне важно как в медицине, так и в биотехнологии. Нарушение гомеостаза зачастую связано с дисбалансом скоростей образования и расходования метаболитов,
а все химические реакции в организме контролируются
ферментами. Таким образом, для приведения организма в
норму требуется точное понимание
какой степени следует ускорить или замедлить. Аналогично, при получении тех или иных продуктов ферментативных реакций необходимо количественное описание процесса для наиболее эффективного использования биокатализатора. В настоящем разделе приводятся сведения о количественном описании ферментативных реакций и факторов,
влияющих на наблюдаемую активность биокатализатора
ферментов и фермента-
того, какую реакцию и в
.
39
3.1. Стационарная кинетика ферментативных реакций.
Дифференциальная форма уравнения Михаэлиса-
Ментен
Многочисленный экспериментальный материал, накопленный к началу XX века, показал, что ферментативные реакции характеризуются следующими особенностями:
1) порядок реакции по ферменту первый;
2) зависимость накопления продукта реакции (или расхо-
да субстрата) от времени имеет протяженный стационарный
режим, где скорость реакции постоянна (рис. 3.1, А);
3) зависимость стационарной скорости реакции от на-
чальной концентрации
субстрата имеет гиперболический
вид, где порядок реакции меняется от первого до нулевого
(рис. 3.1, Б).
[P]
tg = v
время
o
A
o
v
Б
[S]
o
Рис. 3.1. Зависимость накопления продукта ферментативной
реакции от времени (А) и скорости ферментативной реакции от кон-
центрации субстрата. Общий вид.
Идея о принципе биокатализа, выдвинутая в работе Лео-
3
нора Михаэлиса и Мод Ментен
, заключалась в том, что меж-
ду субстратом и ферментом быстро и в равновесном режиме
3
L. Michaelis, M. L. Menten. Die kinetic der invertinwirkung. –
Biochemische Zeitschrift, 1913, V.49, P.333–369.
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]