Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Прикладная энзимология. Учебное пособие
.pdf
уравнение (3.22) кинетических параметров зависит от кинетической схемы реакции и может быть различным.
Если в схеме (3.21) коэффициент
> 1, то суммарная
скорость ферментативной реакции в присутствии эффектора
увеличивается, то есть эффектор является активатором. В
случае, когда 0 <
< 1, то суммарная скорость фермента-
тивной реакции в присутствии эффектора уменьшается, то
есть обратимый эффектор является ингибитором. При этом
само ингибирование носит неполный характер. Если же
= 0
ингибирование называют полным – именно такие случаи и
приводятся в классических учебниках по биохимии. Начнем
именно с этих случаев.
3.2.1. Полное обратимое ингибирование
Полное конкурентное ингибирование.
В данном случае
ингибитор взаимодействует только со свободным ферментом:
(3.25)
Конкурентным данный тип ингибирования называют в
силу того, что, согласно схеме (3.25), субстрат и ингибитор
«конкурируют» между собой за связывание с одним и тем
же центром фермента. Кинетический анализ этой схемы в
условиях [S]
, [I]о >> [E]о приводит к следующему выраже-
о
нию для стационарной скорости реакции:
51
K
[I]
[S][E]
ooкат
I][
o
S][)
i
o
(3.26)
k
v
1(
K
S
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.26) в присутствии фиксированных концентраций ингиби-
тора величина максимальной скорости реакции остается постоянной, а экспериментально получаемая величина константы Михаэлиса зависит от концентрации ингибитора согласно уравнению:
I][
o
кажm,
s
1(
KK
)
K
i
(3.27)
Точки пересечения получаемой прямой с осями ординат
и абсцисс дают величины K
и -Ki соответственно.
S
Вид зависимостей скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка и
расчет K
для случая полного конкурентного ингибирования
i
представлен на рисунке 3.3.
1/v
[I]
o
o
А
1/[S]
o
K
K
i
1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1, 5
m, каж
2,5
2,0
1,5
K
1,0
0,5
0,0
S
Б
Рис. 3.3. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (А) и расчет константы
ингибирования (Б) для случая полного конкурентного ингибирования
52
Полное неконкурентное ингибирование. В данном
случае ингибитор способен с одинаковой эффективностью
взаимодействовать как со свободной формой фермента, так
и с фермент-субстратным комплексом, образуя в последнем
случае каталитически неактивный тройной комплекс:
(3.28)
Неконкурентным данный тип ингибирования называют в
силу того, что, согласно схеме (3.28), субстрат и ингибитор
не конкурируют за связывание с ферментом, то есть связывание происходит на разных сайтах. Кинетический анализ
этой схемы в условиях [S]
щему выражению для стационарной скорости реакции:
, [I]о >> [E]о приводит к следую-
о
k
кат
I][
o
1(
K
v
i
K
[S]E][
oo
)
(3.29)
S][
oS
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.29) в присутствии фиксированных концентраций ингиби-
тора константа Михаэлиса не меняется, а экспериментально
получаемая величина k
зависит от концентрации инги-
кат,каж
битора согласно уравнению:
k
k
кажкат,
кат
I][
o
1
K
i
(3.30)
53
Константу ингибирования рассчитывают из графика в
координатах 1/k
- [I]o согласно уравнению:
кат,каж
11
каткажкат,
I][
o
1(
)
Kkk
i
(3.31)
Точки пересечения получаемой прямой с осями ординат
и абсцисс дают величины 1/k
и -Ki соответственно.
кат
Вид зависимостей скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка и
расчет K
для случая полного неконкурентного ингибирова-
i
ния представлен на рисунке 3.4.
2,5
2,0
1,5
1/k
1,0
0,5
0,0
кат
Б
[I]
o
1/v
[I]
o
1/k
o
А
1/[S]
o
кат, каж
K
i
1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Рис. 3.4. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (А) и расчет константы
ингибирования (Б) для случая полного неконкурентного ингибирования
Полное бесконкурентное ингибирование. В данном
случае ингибитор взаимодействует только с ферментсубстратным комплексом, образуя нереакционноспособный
тройной комплекс ЕSI:
54
(3.32)
Анализ кинетической схемы (3.12) в условиях [S]
приводит к cледующему выражению для стационарной
[E]
о
, [I]о >>
о
скорости реакции:
k
кат
I][
1(
K
v
i
K
S
I][
1(
K
[S]E][
o
)
oo
(3.33)
S][
o
i
o
)
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.33) в присутствии фиксированных концентраций ингиби-
тора экспериментально получаемые величины К
k
зависят от концентрации ингибитора, причем абсо-
кат,каж
m,каж
и
лютно одинаково. Их отношение всегда постоянно, поэтому
в координатах Лайнуивера-Берка набор получаемых прямых имеет один и тот же тангенс угла наклона (вид зависимостей скорости ферментативной реакции от концентрации
субстрата в координатах Лайнуивера-Берка для случая полного неконкурентного ингибирования представлен на
рис.
3.5). Константу ингибирования рассчитывают из графиков в
координатах 1/k
– [I]o или 1/К
кат,каж
– [I]o аналогично
m,каж
уравнению (3.31) и рис. 3.4, Б.
55
[I]
o
1/v
o
1/[S]
o
Рис. 3.5. Зависимость скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка для случая
полного бесконкурентного ингибирования
Смешанное полное обратимое ингибирование. Опи-
санные выше варианты полного обратимого ингибирования
относят к так называемым «чистым» случаям. На практике
зачастую реализуются случаи, когда ингибитор способен
взаимодействовать как со свободной формой фермента, так
и с фермент-субстратным комплексом, однако эффективность этих взаимодействий различна:
(3.34)
Анализ кинетической схемы (3.34) в условиях [S]
приводит к следующему выражению для стационарной
[E]
о
скорости реакции:
56
, [I]о >>
о
[S][E]
k
ooкажкат,
v
K
кажm,
]S[
o
(3.35)
где,
k
k
кажкат,
кат
1
K
I][
o
'
i
(3.36)
I][
o
1
K
i
KK
Sкажm,
1
I][
o
'
K
i
(3.37)
Таким образом, при определении параметров уравнения
(3.35) в присутствии фиксированных концентраций ингиби-
тора экспериментально получаемые величины К
k
зависят от концентрации ингибитора, причем по-
кат,каж
m,каж
и
разному. В данном случае константу связывания ингибитора с фермент-субстратным комплексом K
графиков в координатах 1/k
– [I]o аналогично уравне-
кат,каж
’ рассчитывают из
i
нию (3.31), а константу связывания ингибитора со свободным ферментом K
К
m,каж/kкат,каж
- [I]o аналогично уравнению (3.27).
– из графиков в координатах
i
3.2.2. Активация и неполное ингибирование
ферментативных реакций
Рассмотренные выше примеры кинетических схем (3.25),
(3.28), (3.32) и (3.34) представляют собой частные случаи
общей схемы (3.21) обратимого взаимодействия эффектора
57
(в общем случае – как ингибитора, так и активатора) с фер-
ментом. В отличие от случаев полного ингибирования здесь
допускается возможность образования продукта реакции в
результате распада тройного комплекса фермент-субстратингибитор ES. Определить значения α, β и K
в данном слу-
i
чае можно раздельным анализом зависимостей величин наблюдаемых кинетических параметров К
m,каж
и k
кат,каж
от
концентрации эффектора. Гиперболическое выражение
(3.24) можно традиционным приемом трансформировать в
следующую линейную форму:
1
K
кажm,
K
S
1
1
11
1
K
Э
Э][
o
(3.38)
Согласно выражению (3.38) на графике в координатах
(K
m,каж/KS
– 1)-1 – [Э]
соответствовать прямой с тангенсом угла наклона αK
отсекающей на оси ординат отрезок, равный величине (α - 1)
Иными словами, из анализа зависимости K
деляются раздельно величины α и К
-1
экспериментальные данные должны
o
/(α - 1),
Э
от [Э]о опре-
m,каж
. Величина β определя-
Э
-1
.
ется затем из линеаризации и аналогичного анализа зависимости k
от [Э]о согласно уравнению:
кат,каж
1
k
кажкат,
k
кат
1
1
11
1
K
Э
]Э[
o
(3.39)
Необходимо отметить следующий момент. Как было сказано ранее, рассмотренные в разделе 3.2.1 случаи полного
ингибирования являются частными случаями схемы (3.21).
Действительно, схема (3.21) при
= 0 соответствует случаю
полного смешанного ингибирования по схеме (3.34). При
(константа диссоциации тройного комплекса фер-
мент-субтрат-ингибитор αK
, то есть тройной ком-
Э
58
плекс просто не образуется, в таком случае не имеет
смысла) схема (3.21) и уравнение (3.22) трансформируются
к виду (3.25) и (3.26) соответственно, то есть к схеме и кинетическому механизму полного конкурентного ингибиро-
вания. Аналогично, при
= 1, = 0 схема (3.21) и уравне-
ние (3.21) трансформируются к виду (3.28) и (3.29) соответственно, то есть к схеме и кинетическому механизму полного
неконкурентного ингибирования. Однако для случая бесконкурентного ингибирования, когда величины k
кат,каж
и K
m,каж
изменяются пропорционально, а их отношение является постоянной величиной – см. уравнение (3.33) – ситуация иная.
Бесконкурентное ингибирование согласно схеме (3.21) дос-
тигается при условиях
= < 1. Таким образом, если схема
(3.32) описывает упорядоченный механизм взаимодействия
ингибитора с ферментом (образование тройного комплекса
фермент-субстрат-ингибитор происходит только в результате
связывания ингибитора с комплексом фермент-субстрат), то
схема (3.21) описывает неупорядоченный механизм взаимодействия ингибитора с ферментом (для образования тройного комплекса фермент-субстрат-ингибитор неважно, ингибитор или
субстрат связывается вначале с ферментом). При
этом по схеме (3.32) тройной комплекс не способен к образованию продукте реакции, а по схеме (3.21) тройной комплекс
реакционноспособен. Иными словами говоря, схема (3.32) не
является частным случаем схемы (3.21), а представляет собой
принципиально иной механизм реакции.
3.2.3. Субстратное ингибирование и активация.
Аллостерические эффекты
В качестве обратимого эффектора может выступать и сам
субстрат, вторая молекула которого способна связываться с
ферментом. Общая схема такого процесса выглядит следующим образом:
59
(3.40)
а уравнение для стационарной скорости процесса запишется
как:
S][
o
(
kk
32
'
v
K
S][
K
[S]E])[
oo
S
oS
K
2
]S[
o
'
S
(3.41)
где K’
– константа диссоциации тройного комплекса ESS:
S
]S][ES[
K
'
S
]ESS[
(3.42)
Как и предыдущем случае, ингибирование и активация
связаны с соотношением констант k
и k3 – если k2 > k3, то
2
имеет место ингибирование избытком субстрата, если же
< k3, то наблюдается активация. Рассмотрим несколько
k
2
предельных случаев схемы (3.40).
Полное ингибирование субстратом (k3 = 0). Уравнение
(3.41) в данном случае трансформируется к виду:
k
[S]E][
v
K
S][
oo2
2
]S[
o
oS
K
'
S
k
[S]E][
oo2
K
1(S][
oS
S][
o
)
K
'
S
(3.43)
Отсюда видно, что при относительно низких концентрациях субстрата, когда [S]
<< K’S ([S]o/K’S << 1), уравнение
o
(3.43) приобретает вид обычного уравнения Михаэлиса-
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]